[0001] 本发明涉及一种有机化合物的合成方法，尤其涉及一种稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的合成方法。

[0002] 喹噁啉类化合物是一类具有喹噁啉-N，N-二氧化物结构的物质。研究发现，该类物质具有良好的广谱抗菌作用，且对革兰阴性菌的敏感性特别强，因此可作为抗生素使用，如卡巴氧。不仅如此，在实际使用中发现，许多喹噁啉类衍生物还具有蛋白质同化、促进家畜生长和提高饲料转化率的作用，如喹乙醇。基于此，该类物质曾经被广泛应用于饲料添加剂。然而，随着进一步的研发，科研人员发现该类化合物极易在生物体内累计，且被生物代谢后的产物，具有明显的DNA损伤、致畸、致癌等毒副作用。人一旦食用喹噁啉类药物超标的家畜后，极易引起中毒。为此，国外最早在1999年的时候，便已禁止在动物养殖过程中使用该类药物。我们国家也已经有明确的规定，禁止将该类物质用于家畜养殖业中。因此，对于该类物质的检测是十分必要的。由于喹噁啉类化合物进入生物体后已被代谢，所以世界卫生组织将喹噁啉-2-羧酸作为喹乙醇、卡巴氧等喹噁啉类药物的残留标示物，并在2014年，我国将喹噁啉-2-羧酸认定为必检项目之一。

[0003] 针对喹噁啉-2-羧酸的检测方法，国家已出台了一些列的国家标准和农业部标准，主要有高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法两种。其中高效液相色谱法设备要求低，但检测限较高，已越来越无法满足实际检测限的要求。随着质谱设备的普及化，目前液相色谱串联质谱法已成为主流的检测方法。其中，采用质谱法时，为了消除样品前处理和仪器所带来的误差，需要加入稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸作为内标物。然而，目前该物质完全依赖进口，价格极其昂贵。相关的国内标准品公司都无自主生产能力，因此被国外垄断。通过查阅文献和专利，没有发现该物质的合成制备方法。因此，开发稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的制备方法便具有十分重要的社会意义和经济意义。

[0018] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

[0019] 本发明提供的一种稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的合成方法，包括以下步骤：

[0020] S1：先将40％的丙酮醛水溶液与稳定同位素标记的苯胺发生缩合反应后，反应得到稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉；所述丙酮醛水溶液与稳定同位素标记的邻苯二胺的摩尔比为1.5～1.2:1，反应溶剂为甲醇、乙醇或四氢呋喃；

[0021] S2：接着用二氧化硒对稳定同位素标记的2-甲基-喹噁啉进行氧化，形成稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉；二氧化硒与稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉的摩尔比为1.5～2.0:1，反应溶剂为1,4-二氧六环、乙酸乙酯或四氢呋喃；

[0022] S3：最后再将稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉与氧化剂反应，即得到稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸；所述氧化剂与稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉的摩尔比为1.5-2.0:1，所述氧化剂为双氧水、高锰酸钾或过硫酸氢钾，反应溶剂为1,4-二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。

[0023] 本发明的合成方法，其中，所述步骤S1中的反应温度为40～60℃，反应时间12～24小时。所述步骤S2中二氧化硒的氧化反应温度为80～100℃，反应时间3～5小时。所述步骤S3中的反应温度为25～60℃，反应时间2～4小时。

[0024] 本发明的合成路线如下：

[0025]

[0026] 本发明以丙酮醛水溶液和稳定同位素标记的邻苯二胺为原料，经过三步操作简单的有机反应，即可制备得到纯度98％以上，同位素丰度99％以上的目标化合物。图1为稳定同位素标记的2-甲基-喹噁啉的质谱图，其横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度，从图中可以看到，稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉的质谱图中出现了148.12的峰，与理论计算值148.09一致，同时出现碎片离子峰，其谱图与该物质的标准谱图是一致的。图2为稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉的质谱图，其横坐标为质荷比，纵坐标为相对强度，从图中可以看到，稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉的质谱图中出现了158.10的峰，与理论计算值158.07一致，同时出现碎片离子峰，其谱图与该物质的标准谱图是一致的。图1为稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的液相质谱图，图3(A)、图3(B)横坐标分别为出峰时间和质荷比，从图中可以看到，稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的峰质谱图中出现了179.1的峰，与理论计算值179.1一致，为目标化合物结合一个氢离子后的质量，同时出现133.2，57.2的碎片离子峰，其谱图与该物质的标准谱图是一致的，且纯度与同位素丰度经液相质谱法测定为分别
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为98.2％和98.6％。图4为稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸及其未标记物的 H NMR谱图，溶液为氘代二甲基亚砜，横坐标为化学位移。从1H NMR谱图中可以看到，非同位素标记的喹噁啉-2-羧酸有苯环上的峰，但是在稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸中没有发现苯环上的峰，表明氘原子依然在苯环上。

[0027] 实施例1

[0028] S1)将1.12g稳定同位素标记的邻苯二胺溶于20mL甲醇后，滴入2.7g的40％丙酮醛水溶液，置于40度下反应，反应24小时。结束后，冷却至室温，加入80mL乙酸乙酯，依次用1M盐酸(30mL)，水(30mL)饱和食盐水各洗涤一次。无水硫酸钠干燥后，过滤，减压除去溶剂后，通过柱层析法进行分离提纯。选用洗脱剂正己烷：乙酸乙酯＝6:1洗脱产物。最终得到稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉1.19g，为橙色油状液体，产率80.1％。

[0029] S2)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉1.19g，溶于50mL 1,4-二氧六环中，随后加入1.35g二氧化硒，置于100度下反应4小时。反应结束后，冷却，抽滤除去固体，旋蒸除去部分溶剂后，通过柱层析法进行分离提纯。选用洗脱剂正己烷：乙酸乙酯＝4:1洗脱产物。最终得到稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉0.94g，为土黄色固体，产率72.5％。

[0030] S3)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉，溶于20mL 1,4-二氧六环中，随后加入1.1mL双氧水后，置于60度下反应2小时后，冷却至室温。随后，加入30mL质量分数5％的NaOH溶液，随后用二氯甲烷洗涤三次，每次50mL。最后水相用浓盐酸将溶液的pH调节至2-3后，用乙酸乙酯萃取两次，每次50mL，合并有机相后，用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干抽真空后，得到淡红色的目标产物0.95g，产率92.4％。

[0031] 实施例2

[0032] S1)将1.68g稳定同位素标记的邻苯二胺溶于20mL乙醇后，滴入3.24g 40％丙酮醛水溶液，置于60度下反应。反应12小时。结束后，后处理与实例1中的步骤(1)相同，得到稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉1.84g，产率83.3％。

[0033] S2)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉，溶于60mL乙酸乙酯中，随后加入2.68g二氧化硒，置于80度下反应4.5小时。反应结束后，冷却至室温，后处理与实例1中的步骤S2)相同，得到目标产物1.63g，产率81.1％。

[0034] S3)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉，溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺中，再加入过硫酸氢钾6.14g，室温下反应2小时。反应结束后，后处理与实施例1中的步骤S3)相同，得到目标产物1.68g，产率94.3％。

[0035] 实施例3

[0036] S1)将2.24g稳定同位素标记的邻苯二胺溶于50mL四氢呋喃后，滴入4.68g40％丙酮醛水溶液，置于50度下反应。反应18小时。结束后，后处理与实例1中的步骤S1)相同，得到稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉2.53g，产率85.5％。

[0037] S2)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲基喹噁啉，溶于55mL四氢呋喃中，随后加入3.60g二氧化硒，置于90度下反应4小时。反应结束后，冷却至室温，后处理与实例1中的步骤S2)相同，得到目标产物2.18g，产率78.6％。

[0038] S3)将上述得到的稳定同位素标记的2-甲醛喹噁啉，溶于40mL四氢呋喃中，加入0.5M的高锰酸钾溶液40mL，室温反应3小时。反应结束后，加入50mL质量分数5％的NaOH溶液，过滤除去沉淀，溶液用乙酸乙酯洗涤三次，每次50mL。随后将水相的pH用浓盐酸调节至
2-3,再用乙酸乙酯萃取三次，每次50mL。合并有机相，并用无水硫酸钠干燥。抽滤，除去有机溶剂后，得到目标产物2.11g，产率88.2％。

[0039] 综上所述，本发明提供的稳定同位素标记的喹噁啉-2-羧酸的合成方法，制得的喹噁啉-2-羧酸质量好，纯度在98％以上，同位素丰度在99％以上；反应路线设计新颖、实验条件温和、产率高；得到的目标化合物可以作为检测喹噁啉类兽药残留时的内标物使用，大大降低了检测成本。

[0040] 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。