[0001] 本发明涉及从糖甘蔗和制糖甜菜废物加工流产物中生产的提取物，其具有期望的性能和健康益处。更具体地，本发明涉及从糖蜜得到的疏水提取物、生产提取物的方法、提取物的用途、和含有提取物的产品。

[0002] 糖是源于糖甘蔗和制糖甜菜的常见碳水化合物，由于其甜味在食品中使用。普通的食糖(蔗糖)是由一个分子的葡萄糖通过α-l,2-苷结合到一个分子的果糖组成的二糖。食糖是99.5%蔗糖，最生物丰富的二糖。糖类是简单的碳水化合物，根据它们的结构分为单糖、寡糖或多糖。蔗糖源于糖甘蔗和甜菜。

[0003] i)糖加工

[0004] 生产白糖所需要的加工步骤导致生产多种副产物，它们大部分仍为是具有很少或没有营养价值、或者在人应用中使用的废产物。

[0005] 机械收割后，糖甘蔗被运送至碾磨机并在齿形辊之间粉碎。经粉碎的糖甘蔗然后被压榨以提取粗糖汁，而蔗渣(剩余的纤维材料)用作燃料。粗汁然后被加热至其沸点以提取任何杂质，然后加入石灰和漂白剂并除去磨泥。粗汁在真空下被进一步加热以产生块状糖晶体和已知为糖蜜的稠糖浆。两者通过离心机分离，收集糖蜜废流，用作低级动物饲料。块状糖晶体进一步精制以增加它们的纯度。

[0006]

[0007] 来自上述过程的块状糖晶体被进一步精制以产生多种商用的糖产品。块状糖晶体与热浓缩糖浆混合以软化晶体上外层。晶体通过离心机回收并随后溶解于热水。该糖液体然后进一步通过碳化或磷化、过滤、脱色和然后用精细糖晶体接种进行纯化。当晶体已经生长到需要的尺寸，则通过离心机从糖浆分离晶体，干燥、分等级并包装。可能重复几次从糖液体回收糖晶体。所有糖晶体被回收后剩下的黑糖浆也被称为糖蜜。

[0008] 约70%的世界的糖来自于糖甘蔗和约30%来自于制糖甜菜。类似过程用于从制糖甜菜制备糖产品。然而，它是单步而不是两部过程。

[0009] 加工以将甜菜切成薄的条/片/甜菜丝开始。该过程增加了甜菜的表面积，以使得它更容易提取糖。提取在不同浸提器中进行，在浸提器中甜菜保持与热水接触和得到的糖溶液称为糖汁。来自浸提器中的耗尽的甜菜薄片然后加压以从它们中挤出尽可能多的糖汁。现在通过泵将加压的甜菜运送至干燥设备，在干燥设备中它转化为颗粒，其形成一些动物饲料的重要成分。然后清理糖汁，在糖汁可以用于糖生产之前，在称为碳化(石灰(氢氧化钙)的乳汁物和二氧化碳气体)的过程中去除非糖化学物质。形成的碳酸钙(白垩)捕获非糖化学物质和在澄清器中去除(称为泥)。当这个完成时，糖液浓缩，直到糖晶体形成。当晶体已经生长时，晶体和母液的生成混合物在离心机中旋转分成两个部分。在包装和/或贮存准备发送之前，用热空气给与晶体最后的干燥。成品糖是白色和适合于使用。因为人们不可能从糖汁中取出所有糖，所以由存在由甜菜糖蜜制成的甜的副产物。这通常转化成为牲畜饲料或者运送至发酵厂诸如生产乙醇的酿酒厂。

[0010] ii)多酚、多酚苷和酚酸

[0011] 多酚（具有两个或更多个酚基团的化合物）是在包括酒、葡萄、可可和糖甘蔗以及制糖甜菜在内的多种来源中发现的一类植物化学品。天然多酚范围可以从简单分子诸如多酚到大的高度聚合化合物诸如单宁。多酚(或酚类)均具有共同的基本化学组成，即酚环结构。在许多亚类中，例如花青苷和儿茶素中具有至少8000种已确定的多酚。多酚可以以它们的游离形式或作为多酚苷存在。

[0012] 多酚的共轭形式是最常见的，其中各种糖分子、有机酸和类脂（脂肪）与酚环结构相连。尽管具有共同的酚环结构，共轭化学结构、大小和其它取代基的差异导致不同的化学分类，和显著导致各种化合物的作用模式和健康性质的差异。

[0013] 酚酸是简单分子，诸如咖啡酸、香草酸和香豆酸。酚酸形成各种不同基团，其包括广泛分布的羟基苯甲酸和羟基肉桂酸(尽管后两者只具有一个酚环)。羟基肉桂酸化合物(对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸)最常作为羟基羧酸或葡萄糖的简单的酯出现，虽然羟基苯甲酸化合物(对羟基苯甲酸、五倍子酸、鞣化酸)主要以苷的形式存在。咖啡豆特别富集结合的酚酸，诸如咖啡酸、阿魏酸和对香豆酸。

[0014] 在说明书中提及的任何现有技术不是承认或不应该被认为承认或任何形式的暗示该现有技术成为澳大利亚或任何其它管辖区域的的公知常识的一部分，或由本领域技术人员可以合理期望该现有技术被确定、理解和认为相关的。

[0068] 多酚是在包括酒、葡萄、可可、茶、和糖甘蔗或制糖甜菜在内的多种来源中发现的一类植物化学品。然而，本发明人第一个认识到疏水分子包括特定疏水多酚和它们的苷以及酚酸——来自于糖甘蔗或甜菜废流诸如糖蜜——具有特定的健康益处。

[0069] i)含有高多酚和酚酸的糖蜜提取物和其生产的方法

[0070] 发明人已经发现由来自糖甘蔗或制糖甜菜的糖蜜进行疏水聚合物吸附得到的保留物富集疏水分子，特别是疏水多酚和它们的苷以及酚酸。因此，在本发明的一方面，提供提供具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物。

[0071] 通过使用短语“疏水化合物”，它意欲指具有足够疏水性以结合疏水吸附树脂的化合物。这些化合物将具有不同程度的水溶性，并且有本领域技术人员将意识到和理解，足够疏水性将等同于结合疏水性吸附剂和必须被洗脱的化合物。即，化合物通过洗涤吸附剂将不被去除。

[0072] 通过使用短语“相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物”，它指包括多酚在内的疏水化合物的水平增强或富集，使得与在吸附树脂上加工糖蜜之前的糖蜜相比，本发明的糖蜜提取物具有相对高丰富的疏水化合物，且特别是多酚。如在整个说明书中更详细地所指，“多酚”意欲包括游离形式的多酚、多酚苷、和酚酸。

[0073] 优选地，有关于提取物内的疏水多酚，相对丰富的疏水多酚以至少5倍增加，优选到以至少7倍，和和最优选地以至少10倍。如以上说明，这包括游离形式多酚、多酚苷和多酚酸。例如，在吸附树脂上处理之前，糖蜜以约1800-2100mgCE/100g糖蜜的量具有多酚。因此，本发明的提取物优选地以至少9000mg CE/100g的量具有疏水多酚，更优选地至少
18000mg CE/100g，和最优选地至少21000mgCE/100g。“CE”、或“儿茶素等同物”是总多酚含量的一种测量，表达为mg儿茶素等同物/g原料。

[0074] 如本文使用，术语“糖蜜”指在块糖晶体在制糖甘蔗工厂中收集后留下的深色糖浆、在糖甘蔗糖浆在炼糖厂中最后一次离心后剩下的黑色糖浆或甜菜糖蜜。优选地，使用的糖蜜是来自制糖甘蔗工厂。

[0075] 本发明的提取物代表经济有用和可以在各种各样的应用中使用的新产品。相应地，在本发明的另一方面，提供包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂的治疗组合物。

[0076] 术语“治疗组合物”是包括肠内和肠外的药物制剂、保健营养品、补品、功能食品和草药制剂的广义术语，它们中的一些在以下更详细地说明。合适制剂的实例包括片剂、粉剂、咀嚼片、胶囊、口服混悬剂、混悬剂、乳剂或流质、儿童制剂、肠内进料、保健营养品、栓剂、喷鼻剂、饮料和食品产品。载体可以包含任何合适的赋形剂诸如淀粉或聚合物粘结剂、甜味剂、着色剂、乳化剂和包衣。优选地，载体是食物产品或食物成分诸如糖。

[0077] 治疗组合物可以以适合于给与到对象的任何形式。治疗组合物可以局部、口服给与或通过任何其它途径给与。

[0078] 本发明的组合物和方法具有在人用药品、化妆品和美容行业、兽医药品以及总之在家养和野生畜牧业中应用。因此如本文使用的术语“动物”指任何动物。优选地，动物是哺乳动物和更优选地为人。“动物”也包括家畜品种诸如牛、马、绵羊、猪、山羊、驴子和禽鸟诸如鸡、鸭、火鸡和鹅或家畜诸如猫和狗。动物，无论是人或非人动物，也可以称为个体、对象、患者、宿主或接受者。

[0079] 虽然在本领域中有方法，该方法使得糖甘蔗或制糖甜菜产品经受提取和纯化过程，但是本领域将意识到，根据使用的纯化/提取/处理方法，最终产品的多酚成分将变化。首次，该申请描述了包含了以下步骤：将糖蜜在疏水吸附树脂上通过(根据以下图)，以产生与没有被暴露于吸附树脂的糖蜜相比具有相对比较高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的提取物。

[0080]

[0081] 在本发明的这个发明的一个实施方式中，提供产生具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的方法，包括以下步骤：

[0082] a.将糖蜜的样品与疏水吸附树脂在足够实现化合物与吸附树脂结合的条件下接触；和

[0083] b.洗脱化合物

[0084] 其中来自步骤(b)的洗脱产物与糖蜜的样品相比，具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物。换句话说，来自步骤(b)的洗脱产物与在步骤(a)之前的糖蜜的样品相比，具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物。优选地，疏水化合物用30-70%乙醇洗脱，最优选地为40%乙醇。

[0085] 如本文使用，除了在上下文以其它方式要求外，术语“包括”("comprise")和该术语的变体诸如包括("comprising","comprises"和"comprised")不意欲排除进一步添加剂、组分、滋味素质或步骤。

[0086] 优选地，在提取物内的疏水多酚是比在吸附树脂上处理之前的糖蜜高至少5-10倍，和以至少以9000mg CE/100g糖蜜提取物的量存在，更优选地为至少18000mg CE/100g糖蜜提取物，和最优选地为至少21000mg CE/100g糖蜜提取物。

[0087] 优选地是，疏水吸附树脂是聚苯乙烯、非离子、疏水交联聚合物，同时含有连续聚合物相和连续多孔相，和可以以块或柱形式使用。这使得足够疏水性的化合物能够分离以结合疏水吸附树脂，包括来自糖蜜的多酚。优选地，大规模方法利用柱(即固定床)模式。TM TM
在本发明中使用的有用的吸附树脂是Amberlite XAD16N 。优选地是吸附树脂是食品级，TM TM
特别是人使用的食品级的。有用的食品级吸附树脂是Amberlite FPX66 。

[0088] 来自糖甘蔗或制糖甜菜的糖蜜与水溶液混合，优选地与水混合，以形成稀释的糖蜜溶液。优选地是，糖蜜是10-40%w/v溶液，和更优选地为大约20%w/v溶液。沉降物和未溶解的物质可以任选地通过以下方法从稀释糖蜜溶液中去除：通过离心分离，或者更优选地，通过适当尺寸的过滤器过滤。0.1μM不锈钢过滤器是一种这样的选择，虽然本领域技术人员将意识到在本领域中其它合适的过滤器。稀释的糖蜜然后与吸附树脂在足够使疏水化合物与吸附树脂能够结合的条件下接触。典型地，糖蜜样品以2-6L/min流速装载到柱上，优选地为4L/min。也可能的是根据样品保留与吸附树脂接触的时间长度，限定提取过程。优选地，在一个实施方式中，稀释的糖蜜留下与吸附树脂接触的时间段为30-120分钟，和更优选地为至少约60分钟，在环境温度。在第一次流过后，糖蜜可以任选地至少再次地循环穿过柱中树脂，更优选地为两次，总共3个循环。

[0089] 接下来用水溶液诸如水冲洗吸附树脂的步骤，保留物然后洗脱，优选地用醇洗脱，以产生具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的糖蜜提取物。30-80%v/v乙醇是在洗脱保留物中使用的一种合适的醇，以2-6L/min的流速通过柱，优选为4L/min。洗脱步骤也可以根据时间限定。优选地，在一个实施方式中，乙醇可以与吸附树脂混合至少
2-15分钟的时间段，以确保尽可能多的疏水化合物与吸附树脂解吸。使用30-70%乙醇，优选为40%乙醇。

[0090] 从洗脱步骤得到的提取物可以通过闪蒸进行浓缩。确定蒸发的合适条件将在本领域技术人员的范围之内。蒸发的合适示例性条件包括：

[0091] 进料流速：150-200L/hr；优选为约180L/hr

[0092] 进料预加热速度：40-50℃；优选为45℃

[0093] 再循环速度：180-200L/hr；优选为约195L/hr

[0094] 工作真空：5-10kPaabs；优选为约8kPaabs

[0095] 容器温度：30-40℃；优选为约32-36℃

[0096] 因此提供了生产具有比糖蜜高5-10倍水平的相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的方法，包括以下步骤：

[0097] a.稀释糖蜜产生10-40%w/v水溶液；

[0098] b.任选地，过滤在步骤(a)中产生的稀释糖蜜；

[0099] c.将稀释糖蜜与疏水吸附树脂在足以使化合物与吸附树脂能够结合和稀释糖蜜中所有其它化合物流过的条件下接触；

[0100] d.任选地，将来自步骤(c)的流过再次在疏水吸附树脂上通过；

[0101] e.任选地冲洗疏水吸附树脂；和

[0102] f.洗脱结合到疏水吸附树脂上的化合物以产生提取物

[0103] 其中步骤(f)中产生的提取物具有比在进行步骤（b）-(f)之前的糖蜜样品高5-10倍相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物。优选地，疏水化合物用30-70%乙醇洗脱，优选地为40%乙醇，和糖蜜提取物以至少9000mg CE/100g的量含有疏水多酚，更优选为至少18000mg CE/100g，和最优选为至少21000mg CE/100g。

[0104] 该方法产生适合于冷冻干燥的浓缩提取物。

[0105] 除了为了去除步骤(b)中的沉降物和不溶物质的目的任选地过滤糖蜜之外，在将糖蜜暴露于吸附树脂之前，产生提取物的该方法不进行糖蜜的任何预处理步骤以去除其它物质。现有技术方法使含有多酚的物质进行其它纯化和过滤步骤以去除较高分子量化合物和多酚，这给予物质不期望的颜色和味道。本发明的方法不包括为了去除这些多酚或其它组分的特定目的的任何步骤，和由糖蜜的疏水吸附树脂生成的本发明的提取物保留了大量的这些多酚。因此，提供了生产具有比糖蜜高5-10倍的相对高丰富的疏水化合物的提取物的，其中在糖蜜与疏水吸附树脂接触之前不进行任何预处理步骤，其将去除高分子量化合物包括高分子量多酚(除了上述提到的沉降物或不溶物质中的之外)。换句话说，在本发明的方法中使用产生具有相对高丰富的疏水化合物的糖蜜、或稀释的糖蜜是没有处理的糖蜜，其没有进行处理去除高分子量化合物。

[0106] 在本发明的进一步实施方式中，当通过本发明的方法生产时，也提供来自具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜的提取物。

[0107] 在从糖蜜生产具有相对高丰富的疏水化合物的提取物的可选方法中，疏水化合物可以从糖蜜使用选择性吸附方法去除，由此疏水化合物，包括多酚，使用合适的溶剂进行提取。合适的溶剂包括但不限于乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯、或其混合物，和其稀释物诸如50/50乙醇/水。含有多酚的溶剂然后可以进行另外纯化步骤以去除任何固体物质，然后真空蒸发产生提取物。

[0108] ii)糖蜜提取物的表征

[0109] 本发明的糖蜜提取物以至少9000mg CE/100g的量含有疏水多酚，更优选为至少18000mg CE/100g，和最优先为至少21000mg CE/100g。如先前解释，“CE”或“儿茶素等同物”是总多酚含量的测量，表达为mg儿茶素等同物/g原料。

[0110] 本发明的糖蜜提取物中的多酚可以是游离形式的多酚或作为苷、或可以为酚酸。例如，糖蜜提取物可以包括一种或多种以下的多酚、多酚苷和酚酸。

[0111] 选自以下一种或多种的游离形式多酚：芹菜苷配基、儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、山柰酚、地奥司明、藤黄菌素、五羟黄酮、麦黄酮、杨梅黄酮和地奥亭；

[0112] 选自以下一种或多种的多酚苷：地奥司明、麦黄酮-7-O-新橘皮糖苷、荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、和芦丁；和[0113] 选自以下一种或多种的酚酸：咖啡酸、绿原酸,酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、丁香酸和香草酸。

[0114] 相应地，在本发明的一种实施方式中，提供具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物，其中多酚以以下的混合物存在：

[0115] 选自以下一种或多种的游离形式多酚：芹菜苷配基、儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、山柰酚、地奥司明、藤黄菌素、五羟黄酮、麦黄酮、杨梅黄酮和地奥亭；

[0116] 选自以下一种或多种的多酚苷：地奥司明、麦黄酮-7-O-新橘皮糖苷、荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、和芦丁；

[0117] 和选自以下一种或多种的酚酸：咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、丁香酸和香草酸，

[0118] 和至少以9000mg CE/100g、或至少18000mg CE/100g、或至少21000mgCE/100g的量存在。

[0119] 优选地，游离形式多酚至少为儿茶素、表儿茶素、和五羟黄酮，多酚苷是地奥司明，和多酚酸至少为咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、和丁香酸。更优选地，儿茶素以150-200mg/kg的量存在，表儿茶素以150-220mg/kg的量存在，五羟黄酮以80-150mg/kg的量存在，地奥司明以410-425mg/kg的量存在，咖啡酸以100-320mg/kg的量存在，绿原酸以
100-400mg/kg的量存在，对香豆酸以1100-1300mg/kg的量存在，阿魏酸以700-760mg/kg的量存在，和丁香酸以400-500mg/kg的量存在。

[0120] 多酚苷可以是O连接或C连接的苷。O-苷诸如地奥司明、麦黄酮和芦丁是可水解的，和通过肠中的细菌酶分解、或通过肠细胞壁中的人酶分解为非结合的多酚苷配基，其非常容易吸收。然而，在吸收之前，苷配基可以与葡萄糖醛酸结合，使得非常少的未结合的多酚实际被吸收。

[0121] 然而，C-苷，包括丢失O-苷部分暴露分子的C-苷部分的那些，具有C-C健，其通过酶或酸是不可水解。C-苷因此保留完整的，和没有被任何理论约束，可以作为肠和肾中的葡萄糖转运体的底物，因此阻断葡萄糖转运。荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷和异夏佛塔苷都是C-苷。相应地，在本发明的一个实施方式中，糖蜜提取物富集C-苷，包括但不限于荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。

[0122] 具有以至少9000mg CE/100g、或至少18000mg CE/100g、或至少21000mgCE/100g的量存在、相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的糖蜜提取物，也包含微量元素、包括小量的糖的碳水化合物、水分、灰、和蛋白质。

[0123] 本发明的糖蜜提取物优选地包含以下微量元素，显示为元素(mg)/提取物的重量。

[0124] 表1：

[0125]微量元素 浓度范围 优选浓度
钙 8000-9000mg/kg 8800mg/kg
铁 800-1000mg/kg 860mg/kg
镁 1500-2500mg/kg 2000mg/kg
锰 50-100mg/kg 65mg/kg
钾 100-250mg/kg 190mg/kg
钠 10-50mg/100g 30mg/100g

[0126] 本发明的糖蜜提取物也优选地不包含或包含最小限度的单糖和二糖糖。使用“最小限度的糖”，它意味着总的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和麦芽三糖小于2g/100g提取物，和优选地按照如下小于1g/100g提取物：

[0127] 表2：

[0128]糖 浓度
果糖 <0.2g/100g
葡萄糖 <0.2g/100g
蔗糖 0.3g/100g
麦芽糖 <0.2g/100g
乳糖 <0.2g/100g
麦芽三糖 <0.2g/100g
总糖 <1g/100g

[0129] 本发明的糖蜜提取物不含有可检测的脂肪、或以0.1g/100g提取物以上的量存在的脂肪酸。提取物也是含水低的。使用“含水低”，它指有小于10g水分/100g提取物，或小于10%，和优选地为小于6g/100g提取物，或小于6%。

[0130] 本发明的糖蜜提取物也可以以1-5g灰/100g提取物的量包含灰，优选地为2.5g-3.5g灰/100g提取物。

[0131] 通过检测氮，有可能确定本发明的糖蜜提取物的蛋白质含量。在这方面，蛋白质含量估计为5-20g/100g提取物，优选地为10-15g/100g提取物，和最优选为12-13g/100g提取物。除了蛋白质之外，在提取物中存在的其它含有N的化合物可能是生物碱。

[0132] 除了单糖和蔗糖之外的碳水化合物以约25-50g/100g提取物的量存在，优选地为30-40g/100g。

[0133] 虽然糖蜜提取物的单糖和二糖含量小于2g/100g提取物，和优选地小于1g/100g提取物，聚合糖基残基在提取物内包含，且根据以下形成部分的糖蜜提取物的碳水化合物含量：

[0134] 表3：

[0135]糖基残基: 质量/300ug Mol%1
阿拉伯糖(Ara) 0.6 0.6
鼠李糖(Rha) 0.8 0.8
海藻糖(Fuc) n.d. -
木糖(Xyl) 0.9 0.9
葡萄糖醛酸(GlcA) n.d. -
半乳糖醛酸(GalA) n.d. -
甘露糖(Man) 0.2 0.1
半乳糖(Gal) 0.1 0.1
葡萄糖(Glc) 112.2 97.5
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) n.d. -
N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) n.d. -

[0136]N-乙酰甘露糖胺(ManNAc) n.d. -
总数 114.7

[0137] 1值表述为总的碳水化合物的摩尔百分比。总的百分比由于舍入可以加起来不正好100%;n.d=没有检测到。

[0138] 因此，本发明的提取物优选地包括约25-50g/100g提取物，优选地为约30-40g/100g，其中多于90%是葡萄糖残基的聚合物(不是游离葡萄糖)。

[0139] 相应地，在本发明的一个实施方式中，提供具有以至少9000mg CE/100g、或至少18000mg CE/100g、或至少21000mg CE/100g的量存在、相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物，并且进一步包括以下的一种或多种：

[0140] 选自以下的一种或多种的微量元素：钙、铁、镁、锰、钾和钠；

[0141] 蛋白质和其它含氮化合物；和

[0142] 除了单糖和蔗糖之外的碳水化合物

[0143] 其中提取物具有小于2g单糖和蔗糖/100g提取物。

[0144] 更优选地，提供具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物，其中提取物包括

[0145] 在选自以下的游离形式多酚、多酚苷和酚酸的混合物中至少9000mg CE/100g疏水多酚，游离形式多酚选自：芹菜苷配基、儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、山柰酚、藤黄菌素、五羟黄酮、麦黄酮、杨梅黄酮和地奥亭；多酚苷选自：地奥司明、麦黄酮-7-O-新橘皮糖苷、荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷、异夏佛塔苷和芦丁；和酚酸选自：咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、丁香酸和香草酸；

[0146] 选自以下的一种或多种的微量元素：钙、铁、镁、锰、钾和钠；

[0147] 蛋白质和其它含氮化合物；和

[0148] 除了单糖和蔗糖之外的碳水化合物；

[0149] 其中提取物具有小于2g单糖和蔗糖/100g提取物。

[0150] 优选地，疏水多酚以至少至少18000mg CE/100g、或至少21000mg CE/100g的量存在。

[0151] 在上述包含微量元素的每一个实施方式中，存在的微量元素以8000-9000mg钙/kg提取物、800-1000mg铁/kg提取物、1500-2500mg镁/kg提取物、50-100mg钾/kg提取物、100-250mg钾/kg提取物和10-50mg钠/100g提取物的量存在。在含有蛋白质和含氮化合物诸如生物碱的实施方式中，蛋白质和含N化合物以1-15g蛋白质和含氮化合物/100g提取物的量存在。

[0152] 上述实施方式中的每一个的碳水化合物组分是25g-50g/100g提取物，和优选地为30-40g/100g，和在其中，多于90%是聚合葡萄糖残基。

[0153] 具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的糖蜜提取物具有高的氧自由基吸收能力(ORAC)值。ORAC值通过以下中描述的方法计算：Cao G,Alessio H,Cutler R(1993)."Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants".Free Radic Biol Med14(3):303–11。粗糠报道是最佳抗氧化食物产品中之一，具有312400μmol TE/100g的ORAC值。本发明的糖蜜提取物，具有350000-385000μmol TE/100g范围的总ORAC值，至少高20%。

[0154] iii)糖蜜提取物的用途

[0155] 如上述，发明人已经发现给与本发明的提取物对于给与提取物的个体可以取得重要的生理作用和重要的健康结果。如本文描述的提取物可以在治疗能力中使用，为了治疗和/或预防多种状况。

[0156] 申请人较早的工作表明，当与消费相同食品而没有加入这些化合物的相比，给与糖蜜过滤提取物到动物能够通过增加廋质量与脂肪质量的比例来改变体重分布。这些体重改变化合物包括多酚和牛奶生物活性物(WO2006/128259)。在本申请中，已经发现具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的糖蜜提取物通过增加能量排泄和/或通过影响参与脂肪和糖氧化和胰岛素敏感性的机理，可以减小总的体重和/或最小化脂肪积累。

[0157] 相应地，在本发明的一方面，提供通过以有效减小总体重和/或最小化动物的脂肪积累的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减小体重和/或最小化动物中脂肪积累的方法。

[0158] 通过使用“减小体重”，它意味着动物具有它们的体脂肪的量减小。通过使用“最小化脂肪积累”，它意味着动物不增加其体脂肪的量。

[0159] 在本文使用短语“以有效量”指足以取得期望结果的量。例如，减小体脂肪、最小化脂肪积累的有效量，或有效减小能量吸收的量。对于动物有效量的实例是1-5%的饮食，优选地为2-4%的饮食。假定人正常消耗1000g食物/天，而多酚的正常消耗是1g/天，有效量可能是在10-50g/天的范围，更优选地为20-40g/天。

[0160] 没有被任何理论约束，相信包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的组合物减少能量吸收和/或改变脂肪代谢。它也可以影响能量消耗。能量消耗主要为产生的内热和外功的总和。在这种情况中，作为内热产生的结果，它是能量消耗。反过来产生的内热主要为基础代谢率(BMR)和食物热效应的总和。包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的组合物可以增加接受本发明的提取物的个体的代谢，即增加能量消耗。

[0161] 相应地，在本发明的另一个实施方式中，提供通过以有效减小能量吸收和/或改变脂肪代谢的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减小能量吸收和/或改变脂肪代谢的方法。

[0162] 在本发明的一个实施方式中，提供通过以有效减小能量吸收的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减小能量吸收的方法。更具体地，糖蜜提取物增加碳水化合物的排泄、或减小碳水化合物的吸收。因此，本发明提供以有效减小碳水化合物的吸收和/或增加碳水化合物的排泄的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减小能量吸收和/或增加能量排泄的方法。

[0163] 在本发明的另一个实施方式中，提供通过以有效改变脂肪代谢的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，改变脂肪代谢的方法。

[0164] 在本发明的一个实施方式中，提供通过以有效增加基础代谢率的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，增加哺乳动物中的基础代谢能量消耗的方法，哺乳动物优选地为人，由此增加基础代谢能量消耗。

[0165] 在优选的实施方式中，提取物占饮食的多至1%、2%、3%和4%。

[0166] 也设想含有本发明的提取物的组合物能够改善健康成人中的疲劳和能量水平。在本发明的这种实施方式中，提供通过以有效减小能量吸收的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减轻或减小疲劳的严重性的方法。类似地，相信，给与包括本发明的提取物的组合物可以改善和增加动物中的能量水平，以有效的量给与组合物到动物。

[0167] 在优选的实施方式中，提取物占饮食的多至1%、2%、3%和4%。

[0168] 也认为本发明的提取物的组合物对于超重的个体具有其它有益的效果。虽然存在为什么个体是肥胖或超重的多个原因，已经表明那些个体可能具有它们应答蔗糖的饱食的缺陷(Linton等人，1972)。通过饱食应答、或饱腹感，它意味着在消耗食物后的充满或满意的感觉(即，餐后饱腹感)。

[0169] 因此，提供通过以有效减小进一步进食的期望量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，提高个体中餐后饱腹感的方法。

[0170] 作为给与本发明的方法中的组合物的替代，个体可以给与本发明的提取物作为部分的饱腹感诱导食物。

[0171] 给与本发明的提取物也显示对于脂肪因子(胃肠激素)水平的影响，和如上说明，因此可以具有对于脂肪代谢的影响。一种这样激素是脂肪连接蛋白，调节多种代谢过程的蛋白激素，包括葡萄糖调节和脂肪酸分解代谢。尽管专一地从脂肪组织分泌进入血流中，激素的水平与成人中的体脂肪百分比呈负相关。没有被作用的任何理论所约束，相信本发明的提取物直接或间接地导致脂肪连接蛋白的增加的水平。像这样，在本发明的另一个实施方式中，提供通过以有效上调脂肪连接蛋白的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，上调脂肪连接蛋白的表达的方法。

[0172] 给与本发明的提取物也可以导致涉及肝中能量消耗的调节的特定基因的上调表达。例如，PPARα和解偶联蛋白2(UCP2)。PPAR-α是肝中的类脂代谢的调节物。通过涉及脂肪酸转运和过氧化物酶体和线粒体脂肪酸β-氧化的基因上调，PPAR-α的激活促进脂肪酸的摄取、利用和分解代谢。认为UCP2具有通过生热作用在脂肪酸氧化和能量消耗中的作用。

[0173] 虽然不被作用的任何理论约束，相信本发明的提取物直接或直接地导致包括PPAR-α和UCP2的基因的增加的水平。如此，在本发明的另一个实施方式中，提供通过以有效上调PPAR-α和UCP2的表达的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，上调PPAR-α和UCP2的表达的方法。

[0174] 通过使用“上调表达”，它意味着基因的转录的增加的水平，和任选地为蛋白质产物的表达的增加的水平。

[0175] 在进一步实施方式中，提供通过以有效上调脂肪连接蛋白、PPAR-α和UCP2中的一个或多个的表达的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，减小动物中体脂肪和/或最小化脂肪积累的方法。

[0176] 在含另一个实施方式中，提供通过以有效上调脂肪连接蛋白、PPAR-α和UCP2中的一个或多个的表达的量给与包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物，改善个体中餐后饱腹感的方法。

[0177] 给与本发明的组合物也可以在用于以下的方法中使用：

[0178] 预防和治疗肥胖症、脂肪肝、酒精肝、糖尿病和高脂血症；

[0179] 抑制身体中的糖类的吸收和体重增加；

[0180] 激活双歧杆菌；

[0181] 增强抗氧化活性；

[0182] 提高胰岛素敏感性/应答；

[0183] 增强降血糖活性；

[0184] 增强酪氨酸激酶抑制活性；

[0185] 治疗月经前综合症和月经后综合症；

[0186] 治疗癌症、头痛、痴呆和酒精中毒；

[0187] 增起α-淀粉酶抑制活性；

[0188] 肌肉力量增强；

[0189] 激活线粒体。

[0190] 它也可以显示神经保护作用。

[0191] 也提供有效量的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物，在制备用于减少体脂肪、最小化脂肪积累、减小能量吸收和/或改变脂肪代谢、增加能量消耗、改善和提高动物中的能量水平、减小碳水化合物的吸收和/或增加碳水化合物的排泄和改善餐后饱腹感的药品中的应用。

[0192] 在进一步的实施方式中，提供有效量的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物，用于减少体脂肪、最小化脂肪积累、减小能量吸收和/或改变脂肪代谢、增加能量消耗、改善和提高动物中的能量水平、减小碳水化合物的吸收和/或增加碳水化合物的排泄和改善餐后饱腹感。

[0193] 本发明也提供用于减少体脂肪、最小化脂肪积累、减小能量吸收和/或改变脂肪代谢、增加能量消耗、改善和提高动物中的能量水平、减小碳水化合物的吸收和/或增加碳水化合物的排泄和改善餐后饱腹感的组合物，组合物包括作为活性成分的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物。

[0194] iv)糖蜜提取物作为成分的应用

[0195] 具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的本发明的糖蜜提取物也可以给与动物作为食品或饮料中的成分。提取物优选地通过本发明的方法产生。

[0196] 本发明的治疗组合物也可以加入包括宠物食品在内的食品中。

[0197] 本发明的提取物可以加入食品和饮料中。提取物可以浸渍、混合、乳化、喷涂或涂布在载体之上以改善递送，载体诸如纤维素、甲基纤维素、葡萄糖、环葡萄糖、环糊精、麦芽糖醇、纤维和含纤维生物活性物。递送也可以从表面活性剂、类脂、络合剂、溶剂和在药学领域中已知的助溶剂药物递送系统的多个方面增强，以提高生物利用度、吸收和疗效。

[0198] 如本文使用，术语“食物”或“食品”包括用于人类或非人类消耗的任何可吃产品，诸如但不限于糖果、补品、点心(甜点和开胃菜)、含有可可粉的食品、调味品、饮料、膳食补充剂和包括在动物健康和营养中使用的补品的制剂。可以在过程中任何点加入在得到的食品中期望的另外的成分。在本发明的一个实施方式中，提取物是以糖浆的形式，糖浆可以用于作为来自小麦、玉米、龙舌兰、甜叶菊的常规葡萄糖和高果糖玉米糖浆的替代物，和较低血糖指数(GI)选择。

[0199] 本发明的提取物可以加入食品、饮料和营养剂中，包括而不限于以下：

[0200] ·乳制品—诸如奶酪、黄油、牛奶和其它含牛奶或奶制品的饮料、涂抹调味品和奶制品混合物、冰淇淋和酸奶；

[0201] ·脂肪基产品—诸如人造黄油、涂抹调味品、蛋黄酱、起酥油、烹饪和煎炸油和敷料剂；

[0202] ·谷物基产品—包括谷粒(例如面包和面团)，无论这些物品是烹饪、烘焙或其它方式加工；

[0203] ·糖果—诸如巧克力、冰糖、口香糖、甜点、非奶制品配料、果汁冰糕、酥皮和其它馅料；

[0204] ·运动营养产品，包括粉剂、预混物、果汁、能量棒、等渗饮料和胶质、淀粉基或果冻；

[0205] ·饮料—无论是热或冷(咖啡、茶、可可饮料、谷类、菊苣和其它植物提取物，酒精饮料，碳酸、非碳酸和轻碳酸饮料包括可乐和其它软饮料，粉状软饮料，水果和蔬菜汁饮料，膳食补充剂、早餐饮料、即时预混物和餐替代饮料，运动饮料，能量饮料，调味水饮料；

[0206] ·动物饲料，包括用于伴侣动物诸如狗、猫和马的宠物食品；

[0207] ·其它产品—包括鸡蛋和鸡蛋产品，加工食品诸如汤、预先准备好的面食。

[0208] 类似地，用根据本发明的提取物浸渍或含有根据本发明的提取物的食品级成分诸如可溶纤维(例如，低聚果糖糖)、不溶纤维(例如，甘蔗纤维、燕麦麸)、面粉、淀粉、改性淀粉、果胶、或其它食品，药物或化妆品成分，可以产生具有增强水平的包括多酚在内的疏水化合物的独特食品成分。

[0209] 本发明包括含有根据本发明的提取物单独作为活性成分的食品或者含有根据本发明的提取物与其它活性成分结合作为活性成分的食品。

[0210] 在一个实施方式中，提供包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的早餐饮料。

[0211] 在另一个实施方式中，提供包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的碳酸或低碳酸饮料。碳酸和低碳酸饮料在现有技术中已知为软饮料。

[0212] 在含另一个实施方式中，提供包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的诱导饱腹感食品。

[0213] 在还另一个实施方式中，提供包括具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的宠物食品，其中宠物食品优选地用于包括猫、狗和马在内的伴侣动物。

[0214] v)糖蜜提取物减小GI的应用

[0215] 本发明具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物可以加入其它物质或成分以减小那种物质的GI。通过使用“减小GI”，它指加入提取物的物质的GI比该物质的天然GI要低。它不是必须使得物质自身低GI(即，GI<55)，虽然它根据物质实际上可以这样做。

[0216] 具体地，具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物可以用于减小单糖和二糖的GI。

[0217] 单糖是生物重要碳水化合物的最基本单元。它们是糖的最简单形式和通常是无色、水溶、晶状固体。单谈的实例包括葡萄糖(右旋糖)、果糖(左旋糖)、半乳糖、木糖、核糖、甘露糖、鼠李糖和吡喃木糖。

[0218] 例如，葡萄糖(右旋糖)在以上描述为食品中使用的提取物的合适载体。除了那个之外，将具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物浸渍、混合、乳化、喷涂或涂布在葡萄糖上可以减小蔗糖的天然GI。反过来，使用具有减小的GI的蔗糖制备的食品也具有减小的GI。

[0219] 因此，提供具有从其天然GI减小的GI的单糖，包括加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的单糖。也提供具有从其天然GI减小的GI的单糖，基本由加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的单糖组成。通过使用“基本由.....组成”，它意味着只有提取物和单糖。存在的任何其它成分仅是微量的，和不会以足以对于单糖具有任何作用或抵消糖蜜提取物的GI降低特征的量存在。

[0220] 也提供减小单糖的GI的方法，包括加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的提取物到单糖。优选地，单糖是葡萄糖。糖蜜提取物可以浸渍、混合、乳化、喷涂或涂布在单糖之上。

[0221] 也提供通过用将具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物加入的单糖替代在食品中存在或使用的单糖，减小食品的GI的方法，并且其中加入提取物的单糖与被替代的单糖相比具有减小的GI。

[0222] 加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物到二糖液可以减小二糖的GI。当两个单糖进行缩合反应时形成二糖。像单糖一样，二糖也溶解在水中、味道甜和称为食糖。表1中提供二糖的清单，包括它们的单体组成。因此，提供具有比其天然GI减小的GI的二糖，其包括具有加入二糖的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物。在另一个实施方式中，提供具有比其天然GI减小的GI的二糖，其基本由具有加入二糖的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物组成。进一步提供减小二糖的GI的方法，包括加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物到二糖。优选地，二糖是蔗糖。糖蜜提供物可以浸渍、混合、乳化、喷涂或涂布到二糖上。

[0223] 也提供通过用加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的二糖替代在食品中存在或使用的二糖，减小食品的GI的方法，并且其中加入提取物的二糖与被替代的二糖相比具有减小的GI。优选地，二糖是蔗糖。

[0224] 表4:

[0225]

[0226] 如上概述，本发明的提取物可以用于作为来自小麦、玉米、龙舌兰、甜叶菊等的普通葡萄糖和高果糖玉米糖浆的替代物，作为低血糖指数(GI)选项。可选地，在本发明的另一个实施方式中，具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物可以用于减小这种甜味剂的GI。可选地，在本发明的另一个实施方式中，具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物可以用于减小这些甜味剂的GI。玉米糖浆(也知道为葡萄糖糖浆)是由玉米的淀粉制成的食用糖浆。它含有不同量的葡萄糖、麦芽糖和更高的寡聚糖。玉米糖浆的酶加工转化葡萄糖为果糖，产生高果糖玉米糖浆(HFCS)。HFCS是甜味剂和比玉米糖浆更易溶，且特别是在美国，是蔗糖的一种更便宜的替代物。相应地，HFCS已经在食品工业中替代蔗糖，和常常在多种加工食品和饮料中使用。

[0227] 因此，提供玉米糖浆，具体地为高果糖玉米糖浆(HFCS)，具有比其天然GI减小的GI，由加入到HFCS的具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物组成，与用于减小HFCS的GI的方法一起，包括加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物到HFCS。优选地，糖蜜提取物浸渍、混合、乳化、喷涂或涂布到HFCS上。

[0228] 也提供通过用加入具有相对高丰富的包括多酚在内的疏水化合物的糖蜜提取物的HFCS替代在食品中使用的HFCS，减小食品的GI的方法，和其中加入提取物的HFCS与已经被替代的HFCS相比具有减小的GI。

[0229] 将理解在本说明书中公开和限定的发明延伸至提到、或由文字或附图而证明的单独特征的两个或更多个的所有可选的组合。所有这些不同组合组成本发明的各个可选的方面。

[0230] 本发明现在参照以下非限制性实施例描述。实施例

[0231] 1.糖蜜提取物生产方法

[0232] 来自糖蜜的提取物通过本发明的方法进行制备，但是根据以下服从多个变量：

[0233] 表5:

[0234]

[0235] 测量方法A得当的提取物的总酚，并与方法B得到的相比较。糖蜜提取物中的多酚的量如在以下描述中测定：Kim,Dae-Ok,等人(2003)Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums.Food Chemistry,81,321-26。

[0236]方法A批次 185.4mg CE/g(18540mg CE/100g)
方法B批次 193.3mg CE/g(19330mg CE/100g)

[0237] 方法B发现具有多于5%含量，表明过滤提取物和然后用40%乙醇洗脱的优势。较低浓度乙醇溶液从成本和安全角度讲也是有利的。

[0238] 2.糖蜜提取物的表征

[0239] i)多酚

[0240] 为了进一步表征在本发明的糖蜜提取物中发现的多酚的类型，进行联合的HPLC和串联质谱步骤。

[0241] 样品提取和制备：1.5g的提取物放入10mL的80%甲醇(150mg/mL)中，和在4℃过夜提取。在提取后，样品以18,000x g离心10分钟以使得特定物质成粒。1mL的离心物质放入玻璃管中，和样品使用空气完全干燥。一旦干燥后，样品重新悬浮在500μL的0.1%甲酸(浓度～300mg提取物)中用于HPLC分析。

[0242] HPLC分析:具有二极管阵列检测器的Agilent1100HPLC用于所有分析物。使用的HPLC柱是Phenomenex Luna5u C18(2)100埃250x4.6mm，具有WideporeC184x2.0mm保护柱体。所有的溶剂是HPLC级，和使用双蒸水。溶剂A：2%乙腈/0.1%甲酸，溶剂B:90%乙腈/0.1%甲酸。

[0243] 在试验之前，柱用100%溶剂B清洗，然后在100%溶剂A中平衡。20μL的再悬浮样品(～15mg提取物)注射到柱上。对于提取物的梯度和分级，柱在0%溶剂B、然后0-30%溶剂B(2-27%乙腈)平衡超过90分钟；然后在30-100%溶剂B(27-90%乙腈)中平衡超过1分钟；然后保留100%溶剂B（90%乙腈）超过10分钟；然后100%-0%溶剂B(90-2%乙腈)超过1分钟；然后保留0%溶剂B(2%乙腈)8分钟。在整个HPLC运转的期间中，以5分钟间隔收集部份(监测信号：262nm,4nm带宽–参比308nm,40nm带宽)，空气干燥，和进行质谱(MS)分析。

[0244] MS分析确定识别为以下的多个峰：

[0245] 游离形式多酚-芹菜苷配基、儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、山柰酚、地奥司明、藤黄菌素、五羟黄酮、麦黄酮、杨梅黄酮和地奥亭

[0246] 多酚苷-地奥司明、麦黄酮-7-O-新橘皮糖苷、荭草苷、牡荆苷、木樨草素-8-C-(鼠李糖葡萄糖苷)、夏佛塔苷,异夏佛塔苷、和芦丁

[0247] 酚酸-咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、没食子酸、丁香酸和香草酸。选择多酚的定量

[0248] 多个多酚的浓度在糖蜜提取物的酸性水溶液和碱性部份中测定，然后乙酸乙酯提取。在样品的酸性和碱性溶液中进行乙酸乙酯提取，以确保尽可能多的化合物从样品中提取。每个样品的等分部分(～200mg)溶解在已经酸化(pH1.6)或碱化(pH9.6)的水(10mL)中。4-甲酰苯甲酸酯(7.4μg)作为内标准(ISTD)加入到每个溶液。混合物然后用乙酸乙酯(2x10mL)提取，溶剂在真空(40℃)下蒸发，和在进行HPLC和LC/MS分析之前，混合物在甲酸水溶液(0.1%,5mL)重新组成。

[0249] 表6：

[0250]

[0251] ii)微量元素

[0252] 微量元素通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和电感应耦合原子发射光谱(ICP-OES)测定。10g的糖蜜提取物用于分析。样品进行均化和子样品用重蒸馏的硝酸在DigiPrep板上消化1小时，直到剧烈反应完成。样品然后转移至Milestone微波进一步消化。在用Milli-Q(高纯度)水补充至合适体积后，消化物使用ICP-MS和/或ICP-OES进行微量元素分析。结果如下：

[0253] 表7：

[0254]微量元素 浓度
钙 8800mg/kg
铁 860mg/kg
镁 2000mg/kg
锰 65mg/kg
钾 190mg/kg
钠 30mg/100g

[0255] iii)糖测定

[0256] 约15g的糖蜜提取物用于分析。样品进行均化和子样品精确称重。糖用25mL水在60℃提取30分钟。提取物用25ml乙腈澄清和通过0.45um过滤器过滤进入2mL容器中，适合于HPLC。为了测定常见糖，过滤的溶液通过使用氨基柱与含盐的乙腈/水流动相的HPLC和示差折光检测进行分析。根据含有已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的标准溶液，进行定量。为了测定低浓度糖，通过使用糖ES柱与乙腈和水流动相的HPLC和蒸发光散射检测器(ELSD)分析滤液。根据含有已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的标准溶液，进行定量。通过HPLC软件和生成的报告，进行结果计算。糖蜜提取物含有如在以下表中总结的以下糖。

[0257] 表8：

[0258]糖 浓度
果糖 <0.2g/100g
葡萄糖 <0.2g/100g
蔗糖 0.3g/100g
麦芽糖 <0.2g/100g
乳糖 <0.2g/100g
麦芽三糖 <0.2g/100g
总糖 <1g/100g

[0259] iv)蛋白质

[0260] 通过本领域技术人员已知的凯氏定氮法测定总氮，和蛋白质量根据总氮乘以因子(6.25)估计。糖蜜提取物进行均化和子样品(约2g)精确称重进入凯氏消化管中。硫酸钾的消化帮助，催化剂硫酸铜加入到样品，然后加入20mL的浓硫酸。该管缓慢加热至400℃和温度维持，直到管中的混合物是透明的。透明的溶液消化1小时和使管冷却。

[0261] 当管已经冷却后，加入500mL的蒸馏水。管放置在凯氏蒸馏单元中，和混合物蒸汽蒸馏进入含有50mL的饱和硼酸溶液的烧杯中。蒸馏溶液用标准的0.1N硫酸溶液进行滴定，使用溴甲酚绿和甲基红的混合指示剂。计算：使用以下等式计算总氮：总N(g/100g)=0.14*(滴定度-空白)/样品质量或体积。对于蛋白质估计，总N乘以6.25。

[0262] 根据这个方法，糖蜜提取物的蛋白质量计算为12.6g/100g。

[0263] 为了识别糖蜜提取物的蛋白质组分，提取物的样品现在SDS-PAGE胶上试验进行显示，在胶内胰蛋白酶消化后进行质谱分析。200mg的糖蜜提取物溶解在1mL的1xXT样品缓冲液中。样品以16,000xg离心5分钟，以使任何微粒成团。

[0264] 跑两个SDS-PAGE胶，一个用于胶内胰蛋白酶消化和一个用于可见的蛋白质分析。使用12%标准Bis-Tris XT胶与它们相应的缓冲液。30μg的蛋白质在每个胶上跑四次。

[0265] 胶内消化：样品以26.25μL的总体积(含有30μg的蛋白质)装载到胶上。胶在75V跑5分钟，和然后在120V10分钟，其将蛋白质放入1.5cm的胶中。胶在30%甲醇/10%醋酸中固定10分钟，和用ddH2O洗涤二次，每次5分钟。在洗涤后，四个胶带中的每一个仅低于染色前沿切割，切成方块，和放入1.5mL微型离心管中，加入50mM碳酸氢铵/50%乙腈到微型离心管中以使样品褪色。

[0266] 在褪色后，样品用30mM二硫苏糖醇还原，和用55mM碘乙酰胺烷基化。在烷基化后，胶带脱水，和然后用1:20比例的胰蛋白酶与蛋白质进行覆盖，和在100mM碳酸氢铵中覆盖以增加样品pH至7-8之间。然后使带消化过夜。肽用50%乙腈/5%甲酸提取。在提取后，含有肽的液体进行干燥，重新悬浮在0.1%甲酸中，和使用ZipTip步骤脱盐。脱盐的样品再次干燥和重新悬浮在0.1%甲酸中用于质谱分析。

[0267] 得到串联质谱和一些肽序列通过人工观察推断。这些肽是独一无二的和在任何已知的基因数据库中没有发现。在没有甘蔗基因组序列的情况下，不可能确定这些肽序列是否来自甘蔗。

[0268] v)碳水化合物分析

[0269] 为了得到糖蜜提取物的碳水化合物的经验和更定量测定，分析提取物的糖基组成。通过单糖甲基化糖苷的每-O-三甲基甲硅烷基衍生物的联合的气相色谱/质谱(GC/MS)进行糖基组成分析，单糖甲基化糖苷由糖蜜提取物的样品通过酸性甲醇分解产生。

[0270] 20μg的肌醇加入到300μg的糖蜜提取物。甲苷然后由在甲醇1M HCl中、在80℃(17小时)通过过酸性甲醇分解的干样品制备，然后通过用甲醇中的吡啶和酸酐再次N-乙酰化(为了氨基糖的检测)。样品然后通过用Tri-Sil(Pierce)在80℃(0.5小时)处理进行的过-O-三甲基甲硅烷基化。这些步骤如在以下的先前描述中进行：Merkle and Poppe(1994)Methods Enzymol.230:1-15;York,等人，(1985)Methods Enzymol.118:3-40。
TMS甲苷的GC/MS分析在配合5975B MSD、使用Supelco EC-1熔融石英的毛细管柱(30m x0.25mm ID)的Agilent6890N GC上进行。

[0271] 表9：

[0272]糖基残基 质量(ug) 摩尔%1
阿拉伯糖(Ara) 0.6 0.6
鼠李糖(Rha) 0.8 0.8
海藻糖(Fuc) n.d. -
木糖(Xyl) 0.9 0.9
葡萄糖醛酸(GlcA) n.d. -
半乳糖醛酸(GalA) n.d. -
甘露糖(Man) 0.2 0.1
半乳糖(Gal) 0.1 0.1
葡萄糖(Glc) 112.2 97.5
N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) n.d. -
N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) n.d. -
N-乙酰甘露糖胺(ManNAc) n.d. -
总数 114.7

[0273] 1值表示为总碳水化合物的摩尔百分比。由于舍入，总的百分比可能加起来不正好为100%。“n.d”是不可检测的。

[0274] 如从以上表中的结果可以看出，糖蜜提取物的碳水化合物含量主要由葡萄糖残基组成，少量的其它单糖也检测到。

[0275] vi)水分含量

[0276] 约10g的糖蜜提取物均化用于通过使用砂和真空干燥(砂方法)、或没有砂和常规干燥(无砂方法)的水分测定。

[0277] 砂方法：具有砂、盖和玻璃棒的水分盘在102℃烘箱干燥和冷却，然后所有组件在一起称重至最近0.1mg。2-5g的样品称重至最近至0.1mg，放入水分盘中。将水加入至盘以帮助样品和砂的混合。水分盘放置在蒸气浴上，直到获得砂/样品的可见干燥。盘和组分放置在真空烘箱中和在70和100℃之间的真空下(约5kpa)干燥，取决于样品的糖含量。根据样品基体，干燥时间最小为4小时。在需要的初始干燥时间段后，去除水分盘和组件，冷却、重新称重和再次返回用于进一步1小时干燥。重复称重和干燥过程，直到得到恒定重量。

[0278] 没有砂方法：水分盘和盖放在102℃烘箱中干燥和冷却。干燥组分在一起称重至最接近0.1mg。称重部分的样品(2-5g)至最近0.1mg，放入盘中。盘中的样品然后放在普通烘箱中102℃持续最小4小时，取决于样品基质。然后去除盘和盖，冷却，重新称重和再次返回进一步干燥1小时。重复称重和干燥过程，直到得到恒定重量。

[0279] 为了确定两种方法中的水分含量，盘的质量(加上组件或盖，取决于方法)从干燥样品和盘(加上组件或盖)的质量中减去，然后除以得到的样品质量。最后结果然后乘以100，得到为%水分或g/100g的结果。两种方法测定糖蜜提取物的水分含量为5.9g/100g的提取物。

[0280] vii)灰分析

[0281] 灰含量通过称重进入制备的称重灰、烧瓶或坩埚的10g的样品测定。样品分散在容器的底部上，和过量水分在水浴中去除。容器然后转移至马弗炉和缓慢加热至525℃±25℃，直到所有有机质破坏。水中溶解盐增强吸附碳颗粒的破坏。称重剩下的灰产物和发现是作为3.1g/100g提取物的存在。

[0282] vii)脂肪和脂肪酸分析

[0283] 通 过 莫 氏 提 取 方 法 (Mills BL 等 人 (1983)J Assoc Off Anal Chem66(4):1048-50))测定脂肪含量。大约10g的脂肪提取物进行均化和子样品(约2g)精确称重放入烧杯中。加入10mL约10%盐酸和混合物在80℃加热，直到水解完成(约0.5小时)。混合物冷却和定量转移至莫氏试管。加入10mL的乙醇和通过摇动提取脂肪，用25ml的乙醚1分钟，和25ml的石油醚和50ml石油醚和乙醚的混合物中每一个再一分钟(石油醚和乙醚混合物进行两次)。在每次溶剂加入之后，和随后摇动，有机层从莫氏试管中滗析进入预称重的玻璃盘。盘然后在102℃烘箱中干燥，直到得到恒定重量。

[0284] 计算：%脂肪=[(盘的重量–盘的重量)/样品的重量]x100。使用这种计算，在本发明的糖蜜提取物中没有发现可检测的脂肪，其中“没有可检测的脂肪”是<0.2g脂肪/100g提取物。

[0285] 除了分析糖蜜提取物的脂肪含量外，也研究脂肪酸组分，基于10g的糖蜜提取物。样品进行均化和取子样品(约1g)。使用氯仿/甲醇或石油醚/异丙醇从样品中提取脂肪。
提取物在氮气下蒸发。需要0.2g脂肪的最小提取质量。提取脂肪使用甲醇的甲醇钠溶液酯化和用甲醇中的硫酸处理。溶液中和和使用正己烷再提取。除去己烷层，使用无水硫酸钠工作和用己烷补充体积。

[0286] 制备样品中的每种脂肪酸甲基酯的相对比例使用具有火焰离子检测的气相色谱测定。根据已知脂肪酸甲基酯包括顺式和反式异构体的标准，通过保留时间作出单个脂肪酸的识别。共轭亚油酸(CLA)的量也可以由FAME的色谱图确定。使用仪器软件提供部分的甲基酯浓度的计算。

[0287] 如从以下的表中可以看出，在糖蜜提取物中不存在可检测的脂肪酸(报道为g脂肪/100g提取物)：

[0288] 表10：

[0289]饱和脂肪 <0.1g/100g
单顺式脂肪 <0.1g/100g
单不饱和脂肪 <0.1g/100g
Ω3脂肪 <0.1g/100g
Ω6脂肪 <0.1g/100g
多顺式脂肪 <0.1g/100g
多不饱和脂肪 <0.1g/100g
顺式脂肪 <0.1g/100g

[0290] viii)抗氧化剂活性

[0291] ORAC值，表明本发明的糖蜜提取物的抗氧化剂清除活性的量，通过在以下描述的方法进行计算：Cao G,Alessio H,Cutler R(1993)."Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants".Free Radic Biol Med14(3):303–11。提取物的ORAC维生素等同物计算为383070μmol TE/100g。

[0292] 3.消费糖蜜提取物对于体重影响

[0293] 在这个实施例中，本发明的提取物（通过方法A制备，参照在以上实施例1中）混合入高脂肪、高碳水化合物鼠饲料，以确定它们的摄入是否帮助阻止肥胖症的发展，和通过增加能量排出和/或通过影响涉及脂肪和糖氧化和胰岛素敏感性的机理，提取物实现阻止肥胖症的发展。以下描述的结果也在猫模型中确认(没有显示数据)，其显示减小体脂肪和脂肪积累的最小化。

[0294] 方法

[0295] 45只C57Bl/6J雄性小鼠维持在含有2%或4%的本发明的提取物或对照添加物的高脂肪高碳水化合物饮食中。动物从六周的年龄喂养饮食12周。在这个12周的时间段中，每天监测小鼠，每周三次测量它们食物和水摄入，和收集排泄物测定能量含量。

[0296] 在动物维持在试验饮食期间，进行以下步骤：

[0297] 第1周-间接的热量测定

[0298] 第8周–排泄物能量排出

[0299] 第10周-葡萄糖耐量试验

[0300] 第12周-分析身体组成(DEXA)和并且仍然在麻醉下，通过终端血尿(经过心脏穿刺)杀死动物，和收集血和组织(脑、脂肪组织、肝和肌肉)样品。

[0301] 1.动物代谢测量分析系统(LabMaster)-热量测定和活性

[0302] 在试验饮食中的它们第一周中，在动物代谢测量分析系统中评定小鼠。在开始热量测定测量之前，动物代谢测量分析系统用标准气体校准，饮水器和食物容器装满和垫草放置在笼中。小鼠单独地放置在动物代谢测量分析系统笼中和使得适应新环境24小时。在这个之后，在小鼠返回到其家笼之前，系统记录动物进一步24小时的数据。

[0303] 2.排泄物能量排出

[0304] 排泄物样品(来自第八周)从每个小鼠中收集，并在单独的箔制容器中在83℃烘箱中放置48小时。在这之后，每个样品使用均化器研磨成粉末和使用压粒机(型号2811,Parr Instruments,Moline IL)压成丸(～0.6g)。丸放入在支架顶部之上的坩埚，
10cm的熔丝系在两个电极之间。样品然后安排在高压气体贮罐内部(型号2811,Parr Instruments,Moline IL)，用1ml的水，其用大气氮气冲洗和用氧气再充满。在开始轰击步骤之前，使用苯甲酸标准品校准热量计，为了核实燃烧方法的化学和涉及结果分析中的能量修正的精确性。热量计(型号1261Parr Instruments,Moline,IL)装满两升的去离子水，和高压气体贮罐在内部稍微降低，确保在淹没之前，点火线插入在高压气体贮罐顶部上的两个端子插座中。氧气然后燃烧，和丸由通过熔丝的电流的通路点燃。温度测量在高压气体贮罐中直接进行和热值由在燃烧过程期间释放的热进行计算。排泄物的这种能量值以MJ/kg计算。

[0305] 3.排泄物类脂、碳和氮分析

[0306] 类脂含量通过将100mg的磨碎排泄物与4ml的氯仿/甲醇(2:1)混合和在60℃温育30分钟进行测定。样品通过Whatman No.1过滤器(Sigma-Aldrich Pty.Ltd.,Castle Hill,NSW,Australia)进入预称重的称舟中和放置在通风橱中以使溶剂蒸发。在重量稳定后，在空的称舟和含有干燥物质的称舟之间的重量差是排泄物类脂量，其表达为开始排泄物样品的重量的百分比。

[0307] 碳(C)和氮(N)分析由干燥均化排泄物粉末进行。使用不同的EL III CHNOS元素分析仪(Elementar Analysensysteme GmbH,Donaustraβe,Germany)分析排泄物的C和N含量。约20mg均化样品包装在锡纸中和称重。样品进行燃烧和在吸附阱中阻滞CO2。N2在热传导检测器中直接测量。在N-测量后，CO2热解吸和进行测量。

[0308] 4.葡萄糖耐量试验

[0309] 为评估葡萄糖耐量，小鼠禁食过夜(其中随意加水)。小鼠放入约束管中，通过用剃须刀片(约1mm)去除尾部的末梢和吸取～5μl的全血进入含有肝素钠的微量吸收池(Hemocue,Medipac Scientific NSW)中，得到基部的禁食血糖浓度。这个然后插入血糖监测器(Hemocue201+,Medipac Scientific,NSW)中和记录禁食血糖浓度。

[0310] 随后，小鼠使用0.5ml糖尿病注射器腹腔内注射葡萄糖溶液(1g/kg体重)。动物然后返回到笼中和从相同的尾部切口在血糖负荷后的30、60和120分钟得到另外的血糖样品。

[0311] 5.通过双能X射线吸收法(DEXA)的体重组成分析

[0312] 在试验饮食的12周后，小鼠的体内的身体组成使用双能X射线吸收法(DEXA)(Norland pDEXA Sabre,Norland Medical Systems,White Plains,NY)进行评估。

[0313] 在扫描之前，DEXA机器使用由制造商提供的已知质量的质量保证和质量控制的标准品进行校准。小鼠通过注射入腹腔内腔的方式进行麻醉(氯胺酮61mg/kg和甲苯噻嗪9mg/kg.)，和放置在DEXA扫描平台上的卧姿中，其中尾部通过胶带固定。

[0314] 动物进行扫描和得到脂肪和无脂肪质量以及骨矿物质含量和密度。当扫描完成后，动物通过终端血尿(经过心脏穿刺)杀死，同时仍然是麻醉的。

[0315] 6.酶联免疫吸附试验(ELISA)

[0316] 在小鼠血浆中存在的廋蛋白和脂肪连接蛋白的浓度通过酶联免疫吸附试验(ELISA)(LINCO,Missouri USA)定量。ELISA微量滴定板孔与结合到表面的抗体一起供给，和含有抗原的样品加入到这儿。板然后进行洗涤去除未结合的蛋白质。加入抗原特异性抗体，然后加入旨在与酶标抗体产生氧化反应的底物，和生成与样品中存在的抗原的量成比例的颜色形成。然后加入停止液以酸化样品和停止反应。在分光光度计中分析酶活性。通过分光光度计检测的吸光度与存在的抗原的量直接成比例，浓度然后根据由已知浓度的参考标准品在相同试验内产生的参考曲线阐明。

[0317] 7.通过核磁共振成像(MRI)体内直观化脂肪组织的分布

[0318] 在14周后(在饮食补充停止后的2周)，6只小鼠(每组n=2)的体脂肪沉积用核磁共振成像(MRI)评估。使用CO2气体杀死动物，它们肢张开卧放在硬纸板上，和转移到墨尔本大学的霍德华·弗洛里研究院。

[0319] 通过核磁共振成像(MRI)显现局部的体脂肪分布。图像在BrukerBIOSPEC47/30MRI扫描仪上得到，该扫描仪装备水平的4.7特斯拉Oxford磁铁。质子密度称重轴位图像，具有以下参数：切片的数量，20；切片厚度，1mm；视野(FOV),6cm；矩阵大小，
256X256；重复时间(TR),815ms；回波时间(TE),获得17.9ms。

[0320] 8.mRNA表达的分析

[0321] 使用Tri-试剂(PE Applied Biosystems,CA,USA)从～100mg的脂肪或肝组织中提取物总RNA。使用Nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific Inc,MA,USA)测定RNA的纯度和比率(A260/A280)值接近于2.0。高容量cDNA反向转录试剂盒(PEApplied Biosystems,CA,USA)用于从来自总的20μL的反应体积的组织的
0.5μg的RNA合成cDNA。通过在25℃持续10分钟、37℃持续120分钟、85℃持续5秒、然后4℃持续30秒温育样品进行反转录。使用基因特异引物组(GeneWorks Pty Ltd,SA,Australia)在1:10稀释的1μl的cDNA进行RT-PCR扩增。用于扩增的正向(正义)和反向(反义)引物的寡核苷酸序列是如在表1中。每个引物对在25μL的终体积中的3.75μM的浓度使用，使用 Green QRT-PCR Master Mix
Kit,1-Step(Agilent Technologies,Inc.,CA,USA)。实时PCR使用MX3000PqPCR机器(Agilent Technologies,Inc.,CA,USA)进行，其中靶表达归一化到相对于CON值的内源性对照(肌动蛋白)的量，通过ΔΔCT方法给出。

[0322] 表11:

[0323]

[0324] 9.统计分析

[0325] 双因素方差分析(ANOVA)，其中在一个因素上重复测量(Statistica V7,Statsoft USA)，用于分析在每组之间的体重以及食物和水消耗。使用单因素方差分析所有其它数据。使用Sigmaplot(9.0,California,USA)计算在葡萄糖耐量试验的曲线下的面积。这个使用梯形积分法进行和然后通过单因素方差分析评估组差别。在适当情况下，进行Post-hoc Fisher PLSD检验。所有的结果呈现为平均值±SEM。小于0.05的p-值认为是显著性的。

[0326] 结果–总结

[0327] 在试验饮食诱导的肥胖症模型中动物消费本发明的提取物，在12周研究期间剂量依赖方式地导致>20%体脂肪的减小(内脏和外周)和约9%的伴随的总体重的减小(统计学意义的)。在用4%的本发明的提取物处理后，观察到减小的体重增加和体脂肪。在用2%提取物处理后，观察到一致的趋势，但是结果对于所有的测试参数不是统计学意义的。

[0328] 详细结果

[0329] 食物和流体摄入：整个试验时间段中的小鼠的每天食物和流体摄入模式的ANOVA分析确认在试验期间任何时间组之间的食物摄入没有差别(没有示出数据)。这确认减小的体重和体脂肪不能够归因于减小的食物摄入。然而，4%提取物组确实比对照组喝得更多(没有示出数据)。

[0330] 脂肪水平:在试验期间的末端时，进行双能量X射线吸收法(DEXA)。小鼠的脂肪和没有脂肪质量进行定量和结果在图1A和B中图解。ANOVA分析揭示4%组比对照组具有更少的脂肪质量，F(2,38)=3.32,p=.047，然而，在无脂肪质量的测量组之间没有差别，F(2,38)=.073,p=.930。

[0331] 最终体重(通过测量死后动物确定)和通过DEXA测量的体重(其不测量流体)在图2A和B中图解。它们都证明在试验的结论，4%组相对于对照具有较低的体重(F(2,38)=3.54,p=.040;F(2,38)=3.94,p=.030)。

[0332] 副作用：也使用DEXA测量骨矿物质密度和骨矿物质含量。这些分析的结果表明在这些测量的任一个中组之间没有差别(数据没有示出)，表明提取物对于骨生长或发育在12周研究中没有有害的作用。在整个研究时间段中的完全没有任何急性或慢性毒性或可观察的不良生理或代谢作用，表明相对高剂量的本发明的提取物在临床前的动物模型中是良好耐受的。

[0333] 葡萄糖耐受:在葡萄糖负荷之前和30分钟间隔后，检查小鼠中的血糖浓度。葡萄糖耐受试验的结果在图3中示出，和证明在它们清除葡萄糖中三组之间没有差别，F(2,39)=.59,p=.558。在消耗本发明的提取物的动物和消耗对照饮食的动物之间的葡萄糖耐受情况的类似情况确认在两个动物群中的足够胰腺功能(即，没有胰岛素耐受性形成的证据)。

[0334] 能量消耗:在接受试验饮食的第一周中，在动物代谢测量分析系统经过间接的热量计测量代谢率。在这时，也测量总的自主活动。在这两个测量中的任一个都没有观察到差别。如通过这些方法评估，在能量消耗中没有观察到变化，表明用本发明的提取物的代谢中的增加可能不是减小体重增加的机理(图4A和B)。

[0335] 排泄物能量排出:在试验饮食中8周后，在小鼠的排泄物排出中评估排出能量。与对照相比，4%提取物处理的小鼠中总的能量输出大4%(图5A)。饮食内的能量的消化率在接受本发明的提取物的两个组中都减小(图5B)。增加的排泄物排出支持了减小的能量吸收是对消耗本发明的提取物的动物中的减小的体重增加负责的机理的假说。

[0336] 排泄物类脂、碳(C)和氮(N)含量。检查上述的排泄物能量中的增加的原因。在试验组和对照组之间排泄物类脂含量没有显著差别(图5C)。单因素方差分析揭示在两个PME治疗组中的表明碳水化合物水平的排泄物C含量相对于对照组是高的(图5D)。当与对照组的相比时，表明蛋白质含量的排泄物N含量在饮食补充4%PME的小鼠中是低的(图5E)。C/N比率在对照小鼠和饮食中补充4%PME的小鼠之间是显著不同的(图5F)。

[0337] 脂肪因子:血浆素蛋白ELISA试验确定相对于对照组，4%组中的小鼠的素蛋白浓度要显著低的。素蛋白是在调节包括食欲和代谢的能量摄入和能量排出中起到重要作用的16kDa蛋白质激素。素蛋白作用于脑的下丘脑中的受体，在其中它通过抵消进食刺激物诸如神经肽Y和大麻素的作用抑制了食欲，以及促进α-MSH的合成，一种食欲抑制物。认为没有素蛋白(或其受体)导致了不受控制的食物摄入。在具有减小的体脂肪的4%组小鼠也具有较低水平的素蛋白的情况证实了减小体脂肪积累相关的数据。

[0338] 在任一的组之间的循环的血浆脂肪连接蛋白中仅有微小差别，表明接受本发明的提取物的动物中的减小的脂肪沉积不是由于增加的能量消耗，而更可能是减少了热量吸附(即，减小的能量吸附)。

[0339] 基因表达–脂肪组织：在来自试验组的动物的脂肪组织中分析基因表达。给与2%和4%的本发明的提取物导致脂肪连接蛋白(主要由小脂肪细胞释放，参与葡萄糖调节和脂肪酸分解代谢)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ(参与脂肪酸贮存和葡萄糖代谢)基因的增加的表达(图7A和B)。在解偶联蛋白2(UCP2)(参与能量消耗)中没有差别(图7C)。给与4%的本发明的提取物也增加脂肪酸合成酶(FAS)表达，参与脂肪酸的合成(图7D)。脂肪连接蛋白、PPAR-γ和FAS的基因表达的增加与身体肥胖的减小一致，可能由于减小的能量吸收。PPAR-γ和FAS的增加的表达与提高的胰岛素敏感性一致。

[0340] 肝mRNA表达：也分析了肝中的基因表达。给与2%和4%的本发明的提取物导致相对于对照动物的PPARα(图8A)和UCP2(图8B)的增加表达。

[0341] 脂肪分布的MRI分析:在14周后(在停止饮食补充后的2周)，用核磁共振成像(MRI)评估6只(每组n=2)小鼠的体脂肪沉积。在试验的饮食诱导的肥胖模型中消耗本发明的提取物的动物总脂肪的减小(内脏和外周)。图9图解在对照小鼠和接受2%和4%的本发明的提取物的小鼠之间所看见的典型结果。

[0342] 对本发明的修改和改进对于本领域技术人员将是非常明显的。这种修改和改进意欲在本发明的范围内。前述描述详述了本发明的某些实施方式。然而，将意识到不论如何详述前述在文本中出现，本发明可以以多种方式实施。如以上也说明，应该说明的是当描述本发明的某些特征或方面时使用特定的术语不应该认为暗示该术语是在本文重新定义，以限制于包括与术语相关的本发明的特征或方面的具体特性。本发明的范围因此根据附加权利要求和其任何等同物进行解释。