牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒 所属技术领域 [0001] 本发明所涉及的牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒，属兽用生物制品领域。 技术背景 [0002] 牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引起的传染病。BVDV在世界范围内广泛分布，给全球乳、肉牛带来巨大的经济损失，山羊、绵羊、猪、鹿及小袋鼠等动物都是BVDV的宿主和传染源。很多牛源的生物制品如牛血清、冷冻胚胎、牛精液这些产品都可能存在BVDV，造成BVDV的传播。另外，很多猪用疫苗生产过程中均需使用牛源原材料，如牛血清、胰酶、牛睾丸细胞等。若这些牛源材料被BVDV污染，则会造成疫苗的污染，造成用该疫苗免疫的猪出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。 [0003] 目前，检测BVDV方法主要有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清中和试验和电镜检查等，这些方法耗时费力，敏感性低，不能满足临床检测的要求。另外，BVDV株与同属的猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）的核苷酸同源性约60％，氨基酸同源性约85％，在血清学上存在交叉反应，用常规的病原检测方法难以对BVDV和CSFV进行鉴别检测和诊断。目前，我国猪瘟活疫苗中BVDV污染情况时有发生，给疫苗质量带来很大威胁。因此，建立特异、敏感的BVDV检测试剂盒，不但能够进行猪、牛等易感动物的BVDV检测，还能够作为一种外源病毒检测方法应用于疫苗生产，为我国动物疫苗质量提供有力的保障。RT-PCR作为一种常用的核酸检测方法，具有特异性好、敏感性高等优点，适用于BVDV的检测。 发明内容 [0004] 本发明的目的是在参考GenBank中BVDV和CSFV序列，设计了一对能够特异性检测BVDV所有毒株的引物，扩增的目的片段长度为470bp，对RT-PCR反应液及反应条件等进行了优化，开发了牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒。 [0005] 本发明的技术方案在于： [0006] 1．该试剂盒含有：阳性对照、阴性对照，RT-PCR反应液，RT-PCR反应酶，引物混合液，无酶水，其中： [0007] 阳 性 对 照：为BVDV Oregon 毒 株MDBK细 胞 传 代 产 物，病 毒 滴 度 为 5.5 10 TCID50/0.1ml，经甲醛37℃灭活后分装； [0008] 阴性对照：为猪瘟病毒兔化弱毒株牛睾丸细胞培养产物，经甲醛37℃灭活； [0009] RT-PCR反应液和RT-PCR反应酶均为大连宝生物公司产品； [0010] 引物混合液的制备：引物合成后用无酶水分别稀释至20μM，然后按1:1混合，引物的序列为： [0011] 序列1，BVU：5’-GGGGGGTAGC AACAGTGGTG AGTTCGT-3’， [0012] 序列2，BVL：5’-TTACCCGACC TACAGTCACC TCTTTTTG-3’； [0013] 无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，次日高压灭菌以去除DEPC。 [0014] 2.牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒的应用，主要用于疑似感染病料中BVDV的检测以及兽用生物制品牛源原料及成品中牛病毒性腹泻病毒的检测。 [0015] 本发明的详细描述 [0016] 1．对照品 [0017] 阳 性 对 照：为 BVDV Oregon毒 株MDBK细 胞 传 代 产 物（病 毒 滴 度 为 5.5 10 TCID50/0.1ml），经甲醛37℃灭活后分装为300μl/管，－20℃冻存备用。 [0018] 阴性对照：为猪瘟病毒兔化弱毒株（HCLV）牛睾丸细胞培养物，经甲醛37℃灭活后分装为300μl/管，－20℃冻存备用。 [0019] 2．试剂 [0020] RT-PCR反应液（PrimeScript One Step RT-PCRKit），为大连宝生物公司产品； RT-PCR反应酶，为大连宝生物公司产品。 [0021] 3．引物的设计和筛选 [0022] 根据GenBank上下载的29条国内外已测得的CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病病毒-Ⅰ(BVDV-Ⅰ)基因组全序列进行综合排列、比较，避开与CSFV同源部分，找出BVDV保守区，针对保守区设计了引物，分别对BVDV和CSFV的RNA进行扩增，最终筛选出一对特异性扩增BVDV RNA，而与CSFV RNA无交叉反应的引物对。引物序列如下： [0023] BVU：5’-GGGGGGTAGC AACAGTGGTG AGTTCGT-3’（序列1）， [0024] BVL：5’-TTACCCGACC TACAGTCACC TCTTTTTG-3’（序列2）。 [0025] 4.反应体系及条件的确定 [0026] 取阳性对照品200μl用常规方法或商品化试剂盒提取RNA。按照表1进行体系配制，反应结束后将RT-PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100v30min。 [0027] 表1牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒反应体系 [0028] [0029] 经过优化后的反应条件为： [0030] 50℃30min；94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，35Cycles；72℃2min； 4℃保存 [0031] 特异性和敏感性研究 [0032] 用牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒对BVDVOregonC24V株和NADL株进行扩增，均扩增出470bp大小的条带，与理论值相符；而HCLV株和牛睾丸细胞对照无扩增条带（图1）。将PCR产物测序后，与标准OregonC24V株(AF091605)和NADL株(M31182)序列进行比对，证明扩增片段为BVDV特异序列。 [0033] 将阳性对照品用MEM进行10倍梯度稀释，每个稀释度用常规方法抽提RNA，用牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒进行检测。结果表明，该方法可检测至10-4稀释度，则本 1.5 试剂盒的检测极限为10 TCID50/0.1ml。 [0034] 试剂盒制备及应用 [0035] 1．试剂盒制备 [0036] 1.1对照品 [0037] 阳 性 对 照：为 BVDVOregon 毒 株MDBK 细 胞 传 代 产 物（病 毒 滴 度 为 5.5 10 TCID50/0.1ml），经甲醛37℃灭活后分装为300μl/管，－20℃冻存备用。 [0038] 阴性对照：为猪瘟病毒兔化弱毒株（HCLV）牛睾丸细胞培养物，经甲醛37℃灭活后分装为300μl/管，－20℃冻存备用。 [0039] 1.2试剂 [0040] 无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，第二天高压灭菌以去除DEPC，分装为1mL/管，2～8℃保存备用。 [0041] RT-PCR反应液，为大连宝生物公司产品，无菌分装为800μl/管。－20℃冻存备用。 [0042] RT-PCR反应酶，为大连宝生物公司产品，无菌分装为50μl/管。－20℃冻存备用。 [0043] 引物混合液的制备：引物合成后用无酶水分别稀释至20μM，然后按1:1混合，分装成50μl/管。 [0044] 2．试剂盒组装（24头份/盒） [0045] 每个反应包括RT-PCR反应液25μl，RT-PCR反应酶2μl，引物混合液2μl，无酶水11μl。每个试剂盒检测24个反应，因此每个试剂盒包含：阳性对照2管，阴性对照2管，RT-PCR反应液1管，RT-PCR反应酶1管，引物混合液1管，无酶水1管。 [0046] 3．试剂盒的应用 [0047] 3.1RNA的抽提及存放 [0048] RNA的抽提采用商品化试剂盒或常规方法抽提RNA。提取的RNA须在2h内进行扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。 [0049] 3.2反应体系配制 [0050] 从试剂盒中取出各组分，室温下融化后，2000r/min离心5s。若有n个待检样本，则所需的反应样本数=n×每个样本重复数+1（阳性对照）+1（阴性对照），每个样本测试反应体系配制见表1。 [0051] 表1牛病毒性腹泻病毒RT--PCR检测试剂盒反应体系 [0052] [0053] 3.3反应条件 [0054] 50℃ 30min；94℃ 2min； [0055] 94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，35Cycles； [0056] 72℃ 2min；4℃ 保存 [0057] 3.4电泳 [0058] 取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100v30min。 [0059] 3.5结果判定 [0060] 3.5.1试验成立条件 [0061] 阳性对照出现470bp扩增条带，而阴性对照无扩增条带。 [0062] 3.5.2结果描述及判定 [0063] 1）阴性：无470bp扩增条带，表示样品中无BVDV。 [0064] 2）阳性：出现470bp扩增条带，表示样品中存在BVDV。 附图说明 [0065] 图1不同样本的PCR产物电泳结果图中：M.DL2000DNA Marker；Lane1.Oregon C24V＋HCLVMix；Lane2.HCLV；Lane3.OregonC24V株；Lane4.NADL株；Lane5.牛睾丸细胞。 [0066] 本发明涉及的微生物信息 [0067] 本发明涉及到的微生物有牛病毒性腹泻病毒BVDV Oregon株和猪瘟病毒兔化弱毒（HCLV）毒株，均由有中国兽医药品监察所鉴定、保存和分发，参见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版2002，中国农业科学技术出版社，2002,p144-145. [0068] 本发明的积极意义 [0069] 本发明涉及牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒。本发明参考GenBank中BVDV和CSFV序列，设计了一对能够特异性扩增BVDV的引物，扩增目的片段长度为470bp，对RT-PCR反应液及反应条件进行优化，发明了牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒。本发明具有以下优点：1)特异性好：特异性扩增BVDV的所有毒株，与其他病原无交叉反应；2)灵敏度高：检测极限可达101.5TCID50/0.1ml；3)操作简单：采用反应预混液，减少操作步骤，缩短反应时间，减少污染风险。本试剂盒可用于猪及牛的BVDV感染检测，也可用于疫苗生产中牛源成分的BVDV污染检测，为动物疫苗质量安全提供有力的保障。 实施例 [0070] 本实施例是为更好地说明本发明，不构成对本发明的限制。 [0071] 实施例1 [0072] ——临床检测 [0073] 采用牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒对8个生产猪瘟活疫苗厂家的94份猪瘟疫苗成品及半成品样本，同时以牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒（BVDV-MGB-RT-PCRkit）（见附注）作为符合，评估该方法的临床推广可行性。 [0074] 1．RNA的抽提及存放 [0075] RNA的抽提采用商品化试剂盒或采用常规RNA抽提方法。 [0076] 2.反应体系配制 [0077] 从试剂盒中取出各组分，室温下融化后，2000r/min离心5s。每个样本测试反应体系配制见下表： [0078] [0079] 3.反应条件 [0080] 50℃ 30min；94℃ 2min； [0081] 94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，35Cycles； [0082] 72℃ 2min；4℃保存 [0083] 4.电泳 [0084] 取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100v30min。 [0085] 5.结果判定 [0086] 阳性对照出现470bp扩增条带（序列3所示序列），而阴性对照无扩增条带。 [0087] 对94份样本检测，牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测试剂盒检出18份阳性，阳性率为19.1％（18/94），其中8份为成品疫苗，检出率为22.2%（8/36），10份为半成品，检出率为 17.2%（10/58）；BVDV-MGB-RT-PCR kit共检出20份BVDV阳性，阳性率为21.3％（20/94）。 二者的符合率为97.9％，说明本检测试剂盒与BVDV-MGB-RT-PCR kit有较高的符合率。 [0088] 附注： [0089] 牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒（BVDV-MGB-RT-PCRkit）使用说明 [0090] （1）RNA的抽提及存放 [0091] RNA的抽提采用商品化试剂盒或采用常规RNA抽提方法。提取的RNA须在2h内进行扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。 [0092] （2）扩增体系的配制 [0093] 从试剂盒中取出各组分，室温融化后，2000r/min离心5s。若有n个待检样本，则所需的反应样本数=n×每个样本重复数+1（阳性对照）+1（阴性对照），每个样本测试反应体系配制见表2。 [0094] 表2BVDV-MGB-RT-PCRkit反应体系 [0095] [0096] [0097] （3）核酸扩增及检测 [0098] 将上述PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 [0099] 循环条件设置： [0100] 第一阶段，反转录50℃/30min； [0101] 第二阶段，预变性95℃/3min； [0102] 第三阶段，88℃/8s，60℃/35s，40个循环，60℃采集FAM荧光信号。 [0103] 试验检测结束后，根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。 [0104] （4）结果判定 [0105] 1）阈值的设定 [0106] 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 [0107] 2）试验成立条件 [0108] 阴性对照无CT值且无扩增曲线，并且，阳性对照的CT值应在15.0～25.0且出现典型的扩增曲线。否则，此次实验不成立。 [0109] 3）结果描述及判定 [0110] ①阴性：无CT值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟病毒。 [0111] ②阳性：CT值≤35且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟病毒。 [0112] ③可疑：CT值>35且出现典型的扩增曲线的样本应重新检测。若CT值≤35和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。