[0001] 本发明涉及的是一种创伤敷料技术领域的方法，具体是一种在木醋杆菌培养基中添加壳聚糖制备吸水性和透湿性更佳、凝血效果更好、生物相容好的壳寡糖/细菌纤维素海绵的方法。

[0002] 在生物医学领域，细菌纤维素由于其独特的生物相容性和生物适应性以及高的持水性和结晶度，在人工血管、医用敷料及组织工程支架的研究越来越多，被认为是目前世界上性能最好的纤维素，因而成为近年来国际上新型生物医学材料的研究热点。

[0003] 壳寡糖具有良好的水溶性，易被人体吸收，使壳寡糖展现出更独特的功能特性和生理活性。壳寡糖具有抗氧化和抑菌性等多种独特的生理功效。此外，壳寡糖还具有良好的吸水性和透湿性。近年来，壳寡糖作为一种新型的功能性低聚糖，不断引起世界各国研究者的浓厚兴趣。

[0004] 传统的创伤敷料往往不能兼具吸水性、透湿性、凝血效果和生物相容性都好的特点，因而其应用受到了限制。

[0005] 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号101288778，公开日2008-10-22，该技术通过将细菌纤维素水凝胶与冰晶充分混合，在–20～–50℃下进行预冻并制成均相分散体系，利用冷冻干燥法制备出细菌纤维素海绵。海绵不良的透湿效果限制了其在临床上的应用。

[0006] 进一步检索发现，中国专利文献号CN202005908 ,公开日2011-10-12，记载了一种“细菌纤维素膜创可贴”，该专利采用的技术路线是：底层为胶布层，胶布层中间粘贴表面上粘贴细菌纤维素膜，细菌纤维素膜上面为覆盖面膜，胶布层两端粘贴表面上有保护膜，覆盖面膜与胶布层对应部位开有透气孔。其缺点是工艺复杂，吸水性和凝血效果达不到要求。

[0027] 实例1: 取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清，加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育1h，每组4个平行样本，在570nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.2191 。

[0028] 实例2: 取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清，加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育2h，每组4个平行样本，在570nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值 ；测得OD值为0.2412 。

[0029] 实例3: 取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清，加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育3h，每组4个平行样本，在570nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为 0.3188 。

[0030] 实例4: 取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清，加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4h，每组4个平行样本，在570nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为 0.4717。

[0031] 实例5: 取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清，加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育5h，每组4个平行样本，在570nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为 0.4705 。

[0032] 实例6：取木醋杆菌细胞培养液，在离心力为5000g离心，弃上清， PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.1232。

[0033] 实例7：取木醋杆菌细胞培养液，在离心力为6000g离心，弃上清， PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.1438 。

[0034] 实例8：取木醋杆菌细胞培养液，在离心力为7000g离心，弃上清， PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.3382。

[0035] 实例9：取木醋杆菌细胞培养液，在离心力为8000g离心，弃上清， PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.4607。

[0036] 实例10：取木醋杆菌细胞培养液，在离心力为9000 g离心，弃上清， PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.4603。

[0037] 实例11：取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心一定时间，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清加入10μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.1833 。

[0038] 实例12：取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心一定时间，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清加入20μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.2497。

[0039] 实例13：取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心一定时间，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清加入30μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.4753。

[0040] 实例14：取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心一定时间，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清加入40μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.4751。

[0041] 实例15：取木醋杆菌细胞培养液，8000 g离心一定时间，弃上清，沉淀用PBS洗涤，离心弃上清加入50μl 0.5 mg/ml的MTT，30℃孵育4 h，每组4个平行样本，在570 nm处采用酶标仪测定OD570值，求平均值；测得OD值为0.4752。

[0042] 实例16：配制培养基M0（w/v%）: 壳寡糖0、葡萄糖3、蛋白胨0.75、酵母粉1、磷酸二氢纳0.75、柠檬酸0.05；以木醋杆菌为生产菌，挑取活化好的菌种接入种子培养基，30℃培养3d，以6%的接种量接入150mL的M1培养基，30℃培养7天。取样经蒸馏水漂洗，1%氢氧化钠溶液煮沸4h，室温0.5%乙酸浸泡0.5h，蒸馏水冲洗5次。采用冷冻干燥法干燥得到BC0海绵样品 。

[0043] 实例17：配制培养基M1（w/v%）: 壳寡糖0.5、葡萄糖2.5、蛋白胨0.75、酵母粉1、磷酸二氢纳0.75、柠檬酸0.05；以木醋杆菌为生产菌，挑取活化好的菌种接入种子培养基，30℃培养3d，以6%的接种量接入150mL的M1培养基，30℃培养7天。取样经蒸馏水漂洗，
1%氢氧化钠溶液煮沸4h，室温0.5%乙酸浸泡0.5h，蒸馏水冲洗5次。采用冷冻干燥法干燥得到BC1海绵样品 。

[0044] 实例18：配制培养基M2（w/v%）: 壳寡糖1、葡萄糖2、蛋白胨0.75、酵母粉1、磷酸二氢纳0.75、柠檬酸0.05；以木醋杆菌为生产菌，挑取活化好的菌种接入种子培养基，30℃培养3d，以6%的接种量接入150mL的M2培养基，30℃培养7天。取样经蒸馏水漂洗，1%氢氧化钠溶液煮沸4h，室温0.5%乙酸浸泡0.5h，蒸馏水冲洗5次。采用冷冻干燥法干燥得到BC2海绵样品。

[0045] 实例19：配制培养基M3（w/v%）: 壳寡糖2、葡萄糖1、蛋白胨0.75、酵母粉1、磷酸二氢纳0.75、柠檬酸0.05；以木醋杆菌为生产菌，挑取活化好的菌种接入种子培养基，30℃培养3d，以6%的接种量接入150mL的M3培养基，30℃培养7天。取样经蒸馏水漂洗，1%氢氧化钠溶液煮沸4h，室温0.5%乙酸浸泡0.5h，蒸馏水冲洗5次。采用冷冻干燥法干燥得到BC3海绵样品。

[0046] 实例20：配制培养基M4（w/v%）: 壳寡糖3、葡萄糖0、蛋白胨0.75、酵母粉1、磷酸二氢纳0.75、柠檬酸0.05；以木醋杆菌为生产菌，挑取活化好的菌种接入种子培养基，30℃培养3d，以6%的接种量接入150mL的M4培养基，30℃培养7天。结果无产物生成。

[0047] 1、壳寡糖—细菌纤维素海绵的微观结构

[0048] 由图1可以看出，与BC0的网状结构相比较， BC1、BC2和BC3海绵表面具有相互连通的孔隙，三维网状结构致密，大孔壁间还具有小孔，孔隙率高、孔隙致密均匀，并且随着壳寡糖量的增加孔径是先变小后变大。

[0049] 由图1还可以看出未经壳寡糖改性的细菌纤维素BC0的纤维网状结构疏松，纤维丝带缠绕不紧密，BC1和BC2纤维丝带缠绕紧密，纤维丝带宽度比BC0大，网孔比BC0密集，BC3和BC1相似。由图可以看出在木醋杆菌培养体系中加入壳寡糖改变了细菌纤维素的物理结构。图2细菌纤维素和壳寡糖-细菌纤维素横截面的SEM示意图；a：细菌纤维素，b-d：壳寡糖的添加量(w/v%)分别为0.5%、1%和2%。

[0050] 2、壳寡糖改变细菌纤维素的渗透性

[0051] 由于细菌纤维素具有三维网状结构，存在分子间孔隙，故细菌纤维素不能阻挡住气体和蒸汽分子的渗透。表2-1结果显示细菌纤维素海绵BC0和改性细菌纤维素海绵BC1、BC2和BC3的透湿性小于医用纱布，且BC3和医用纱布之间存在组间显著性差异（p<0.05），BC2与医用纱布的透湿率相差不大。

[0052] 表2-1 壳寡糖对细菌纤维素透湿性的影响（ ，n=5）

[0053] Tab.2-1 The effect of chitosan on the permeability of bacterial cellulose（n=5， ）

[0054]

[0055] Compared with medical gauze group:*p<0.05

[0056] 由表2-2得出，BC1和BC2的孔隙率大于BC0，BC3的孔隙率小于BC0；可见，由于壳寡糖的增加，改性细菌纤维素的厚度逐渐减小，孔隙也随之减小结构中纤维丝间结合疏松，具有空洞通孔结构，孔隙大导致孔隙率比较高。适量的添加壳寡糖，使改性细菌纤维素海绵具有相互连通的孔隙和较高的孔隙率，BC1和BC2的孔隙率分别为81.37%和78.42%，均大于医用纱布的孔隙率75.32%。

[0057] 表2-2 壳寡糖对细菌纤维素孔隙率的影响（ ，n=5）

[0058] Tab.2-2 The effect of chitosan on the porosity of bacterial cellulose（ ，n=5）

[0059]

[0060] Compared with medical gauze group:*p<0.05

[0061] 改性细菌纤维素BC1、BC2和BC3透湿性在45～65 g/m2·h，满足理想敷料的透湿率2
宜为30～70 g/m·h。显然，这样多孔致密的结构使得材料具有良好的吸水性和透湿性，更有利于伤口渗出液的引导、伤口的透气，孔隙率高有助于通气、营养物质的传输和代谢产物排放，同时较高的孔隙率和较好的连通孔道，可以为细胞生长提供生长所需的孔隙，对创面的愈合具有一定的促进作用；相对均匀的孔径可以阻止外界环境中的微生物及一些杂质进入，保护创伤面，从而缩短创伤面的愈合时间，改性细菌纤维素海绵适合作为创伤敷料。

[0062] 3、壳寡糖对细菌纤维素吸湿性的影响

[0063] 通过表3-1可以发现细菌纤维素海绵的吸湿性都较好，未改性BC0和改性细菌纤维素BC1、BC2和BC3的吸湿性均好于医用纱布，且改性BC2与医用纱布的之间存在显著差异(p<0.05)，BC2吸湿性最好。细菌性维生素分子链中含有较多的强亲水基团，海绵结构也是细菌纤维素海绵吸湿性好的原因之一，改性细菌纤维素具有很好的吸湿性，可以用来吸收创面上产生的渗出液，同时起到为伤口保湿的作用，因此壳寡糖改性细菌纤维素在创伤敷料领域具有一定的应用前景。

[0064] 表3-1壳寡糖对细菌纤维素吸湿性的影响（ ，n=5）

[0065] Tab.3-1 The effect of chitosan on the hygroscopicity of bacterial cellulose（ ，n=5）

[0066]

[0067] Compared with medical gauze group:*p<0.05

[0068] 4、细胞毒性实验

[0069] 图3显示的是BC0、BC1、BC2和BC3对3T3的细胞毒性作用，可以看出BC0、BC1、BC2及BC3和空白对照相比都促进了细胞的生长； BC0和对照组相比，变化不大；与BC0相比，BC1、BC2和BC3对细胞的增殖更有促进作用，其中BC2对细胞毒性最小，随着壳寡糖的增加，改性细菌纤维素对细胞增殖的影响是先增加后减小。由图可以看出BC0、BC1、BC2和BC3的RGR都大于100，所以它们对3T3细胞的毒性都保持在0级。说明了细菌纤维素和壳寡糖都具有很好的生物相容性。

[0070] 5、壳寡糖上调细菌纤维素的抑菌效果

[0071] 测定了BC0及BC1、BC2和BC3对2种供试菌（金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌）的敏感性，如图4和图5，BC0、BC1、BC2和BC3对金黄色葡萄球菌的抑制作用均好于绿脓杆菌；且对金黄色葡萄球菌抑制的效果是:青霉素>BC2>BC3>BC1>BC0，对绿脓杆菌抑制的效果是：青霉素>BC2>BC3>BC1>BC0 。随着壳寡糖量的增加，BC1、BC2和BC3对金黄色葡萄糖球菌和绿脓杆菌的抑菌效果也是先增加后减小，增大是因为壳寡糖具有抑菌作用，这和国内外的研究结果基本一致。抑菌性后来减小是由于随着壳寡糖的增加改性BC1、BC2和BC3的厚度逐渐减小，壳寡糖的含量也随之减小的缘故。所以在创伤敷料中适当的添加壳寡糖，有助于减少外环境中微生物感染创伤面，从而促进创伤面的愈合。

[0072] 6、壳寡糖对细菌纤维素促凝血性能的影响

[0073] 动态凝血时间曲线呈缓慢向下倾斜且经历时间长，表示抗凝血性能优；曲线呈急陡向下倾斜且经历时间短，表示抗凝血性能差。BC0、BC1、BC2和BC3海绵抗凝血性能随时间的变化如图6所示，未改性BC0的相对吸光度值随时间延长呈缓慢下降的趋势，壳寡糖改性的BC1、BC2和BC3的相对吸光度值随时间延长呈较快下降的趋势，说明 BC0的抗凝血性能好于改性细菌纤维素BC1、BC2和BC3，即：壳寡糖改性的BC1、BC2和BC3具有一定的促凝血作用；所以将壳寡糖改性的细菌纤维素应用于创伤敷料具有潜在的意义。

[0074] 综上所述

[0075] 壳寡糖/细菌纤维素海绵呈三维网状结构，孔隙率高，孔隙致密均匀。经实验证实，与传统创伤敷料相比，壳寡糖-细菌纤维素海绵的吸水性和透湿性更佳，凝血效果更好，生物相容性检测的细胞毒性为0级，同时原料便宜易得，制备工艺简单。本发明所制备的壳寡糖-细菌纤维素海绵易于实现工业化生产且生物相容性好，在生物医用材料领域将有着广泛的应用。

[0076] 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。