检测分析物 [0001] 本发明涉及使用增强的电化学阻抗谱（EIS）技术来检测分析物以获得该分析物的数据的方法。该方法是有利的，因为它可以产生超越已知EIS化验方法的提高的速度，并且因此可以改进得出结果的时间（TTR）并且有助于在接近患者的环境中发展此类化验法。 [0002] 用于检测分析物的方法在生物化学分析领域是纵所周知的。在传统的方法中通常用可以检测的（例如通过荧光检测）荧光标记物来标记该分析物，以便辨识该分析物。 [0003] 在过去几年中，在DNA检测领域，已经使用纳米颗粒作为标记物。这些标记物潜在地用于任何允许做标记并且涉及到结合作用的系统，因此在活细胞系统以及蛋白和核酸中可能是有用的。已经发现，这些纳米颗粒克服了更传统的荧光标记物的多项限制，包括成本、使用方便性、灵敏度以及选择性（Fritzsche W，Taton T A,纳米技术 14(2003)R63-R73"Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection（金属纳米颗粒作为异相的基于芯片的DNA检测的标记物）"）。这些纳米颗粒已经用于多种不同的DNA检测方法，包括光检测、电检测、电化学检测和重量分析检测（Fritzsche W，Taton T A,纳米技术14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection（金属纳米颗粒作为异相的基于芯片的DNA检测的标记物）”）。在基于胶体金标志的电化学汽提检测的DNA杂交检测中使用金纳米颗粒一直是成功的（Wang J,Xu D,Kawde A,Poslky R,分析化学(2001),73,5576-5581“Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization（基于金属纳米颗粒的对DNA杂交的电化学汽提电位法检测）”）。 使用半导体纳米晶体（也称为量子点）以及金纳米颗粒也已经成功用作DNA杂交研究的荧光标记物（West J,Halas N,Annual Review of Biomedical Engineering（生物医 学 工 程 评 述）,2003,5:285-292“Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications:Improving Sensing,Imaging and Therapeutics（工程化纳米材料用于生物光子学应用：改善感测、成像和疗法）”）。 [0004] 虽然通过在DNA检测方法中使用纳米颗粒代替之前的荧光标记物发现了优点，但仍需要改进检测方法的灵敏度、选择性以及特别是速度。虽然每种检测方法具有某个程度的灵敏度和选择性，但它们各自具有不同的限制因素并产生不同的不准确性，并且各自不如所希望的快，尤其是对于希望短的得出结果时间（例如，约10分钟）的接近患者环境的测试而言。 [0005] 除此类方法之外，已经在检测DNA时将纳米颗粒标记法与电泳进行了结合（见WO 2009/112537）。电泳是用于加速DNA至电极表面上的互补探针上的结合。该方法是有利的，这是因为它可以产生超过已知化验方法的提高的速度以及灵敏度。 [0006] 除此之外，还日渐需要便宜且简单的检测方法，特别是用于接近患者的环境中的DNA检测。为降低成本、简化方法并且提高检测速度，已经已知的是完全省略贴标记作用。 虽然不使用标记物的检测方法可能具有这些优点，但实现这些标记物提供的灵活性和检测灵敏度是一项挑战。 [0007] 过去已经考虑了在使用和不使用标记物的情况下用电化学阻抗谱（EIS）技术来在分析物上获得数据。以下参考文献提供了背景细节： [0008] EIS在生物传感中的应用综述，Daniels,J.S.,Pourmanda,N.,“Label-Free Impedance Biosensors:Opportunities and Challenges（无标记阻抗生物传感器：机遇与挑战）”,Electroanalysis（电分析）,19,2007,1239-1257。 [0009] EIS在生物传感中的应用综述，Katz,E.,Willner,I.,“Probing Biomolecular Interactions at Conductive and Semiconductive Surfaces by Impedance spectroscopy:Routes to Impedimetric Immunosensors,DNA-Sensors,and Enzyme Biosensors（通过阻抗光谱法探针测量导电和半导电表面处的生物分子相互作用：通向阻抗滴定免疫传感器、DNA传感器以及酶生物传感器的途径）”,Electroanalysis（电分析） 15,2003,913-947。 [0010] KC1溶液中不同尺寸的纳米级电极的阻抗谱的表征，Laureyn,W.,Van Gerwen,P.,Suls,J.,Jacobs,P.,Maes,G.,Electroanalysis（电分析）,13,2001,204-211。 [0011] 检测酶活性的AC阻抗及光谱法，Laureyn,W.,Van Gerwen,P.,Suls,J.,Jacobs,P.,Maes,G.,Electroanalysis（电分析）,13,2001,204-211。 [0012] 集 成 系 统 中 AC 阻 抗 及 IDE，Zou,Z.,Kai,J.,Rust,M.J.,Han,J.,Ahn,C.H.,“Functionalized nano inter digitated electrodes arrays on polymer with integrated microfluidics for direct bio-affinity sensing using impedimetric measurement（聚合物上的功能化纳米指叉状电极阵列以及使用阻抗测量进行直接生物亲和性感测的集成微流体学）”Sens.Acts.A,136,2007,518-526。 [0013] “In situ hybridization of PNA/DNA studied label-free by electrochemical impedance spectroscopy”（通过电化学阻抗谱法而无标记研究的PNA/DNA原位杂交）,J Liu,S.Tian,P. Nielsen,W. Knoll,Chem.Commun.,2005,2969-2971。 [0014] 由此可以看出，AC阻抗测量（通常也称为电化学阻抗谱法或EIS）典型地涉及在两个电极之间施加正弦式小幅值（-10mV）AC电压扰动并且测量在其间产生的随AC频率而变的电流，由此可以作为频率的函数来计算阻抗。已显示，这样的阻抗谱中的变化提供了一种对电极上的特定表面膜中探针-靶标结合进行灵敏的无标记测量的方法，特别是当使用指叉状电极（IDE）如指叉状微电极（IME）或指叉状纳米电极（INE）时。然而，这些测量通常依赖于分析物至电极上、或者至附接于电极上的探针上的结合平衡，因为这决定了结合在该层中的靶标的量。因此EIS响应将遵循平衡热力学。这个程序要求平衡较长时间，通常几个小时，并且有时是在升高的温度下，以便在测量之前确保完全的探针-靶标缔合。这排除了快速的得出结果时间（TTR）。 [0015] 除此之外，IDE的阻抗响应一直是理论上认为的并且典型地使用适当的等效电路来进行分析，在宽的频率范围上拟合该响应以给出等效电路元件（电阻器、电容器、Warburg元件等）的参数，从中可以提取出代表了电化学响应的变化的特征性物理参数（例如，扩散系数、浓度、层厚度）。此外，通常采用在每个频率下的依次测量。这些因素一起增加了以上讨论的较长的得出结果时间，因为它们造成了延长的分析以及测量时间。 [0016] 因此，已知的EIS方法，尤其是无标记方法，典型地是较慢的并且没有对本发明所要求的在接近患者的环境背景中使用提供令人满意的得出结果时间。 [0017] 本发明的一个目的是克服与以上现有技术相关的问题。具体而言，本发明的一个目的是提供一种用于检测分析物的、具有良好灵敏度和选择性的方法，该方法还具有提高的速度以及得出结果时间，并且是便宜且简单易行的。 [0018] 因此，本发明提供了用于检测分析物的方法，该方法包括： [0019] a)对该分析物施加一个交流电压，其中该交流电压包括足以通过电化学阻抗谱法（EIS）区分该分析物的存在性的多个叠加的频率；并且 [0020] b)由EIS数据来确定分析物的身份和/或量。 [0021] 本发明的这第一方面优选使用统计分析来确定有待在步骤(a)中叠加和施加的一组频率。用于以这种方式确定频率的统计方法是本领域熟知的，并且技术人员可以采用任何已知的方法来确定将在本方法中使用的这组频率。此类方法可以例如在“Statistical methods in Experimental physics（实验物理学中的统计方法）”(第2版)，新加坡世界科学出版有限公司（World Scientific Publications Co.Pte.Ltd.Singapore.）F.James编辑,(2006)ISBN 981-256795中找到。 [0022] 若希望的话也可以采用其他确定该组频率的方法。例如，对于具体的系统（例如，特定的电极/溶液/分析物组合），可以提前采用一种经验方法来寻找足够作为该具体系统的标准的一组频率。然后可以在该系统中使用这个标准而无需在每次进行该方法时都计算所要求的频率。也可以实时地或提前地采用任何其他的方法，只要它产生要使用的一组可变频率并且不负面地影响TTR。 [0023] 无论使用何种方法来确定该组频率，这个组应该至少包括足以使用EIS来区分该分析物的存在性所要求的最小数目的频率。若希望的话当然也可以采用附加到最小值之上的频率。 [0024] 在一些实施方案中，该方法在该组频率之外或者代替该组频率还可能涉及确定其他参数，这些参数本身将限定一组频率并且因此有助于实现对该分析物的存在性和/或量的检测。在各自情况下，这些频率和/或参数是为了通过数据分析提供最快的结果产生时间而选择的。 [0025] 典型地，该组频率和/或参数足以区分该分析物的存在或不存在。该组频率的规格不受具体限制，并且它们可以限定为一组特定的单独频率、在一个范围内的一组频率、和/或与之具有间距的单一频率，这限定了该组中的其他频率。 [0026] 使用叠加的频率对EIS测量结果的分析优选是统计性的并且不需要采用等效电路分析方法，这典型地能够获得更快的区分。然而，并不排除该等效电路方法以及任何其他方法，只要TTR不受负面影响。快速傅里叶变换（FFT）分析可以用来提取必需的EIS数据，并且这个信息被用来提供分析物信息。这样的FFT技术是本领域公知的，并且技术人员可以在本发明中按照希望来采用任何这样的技术。 [0027] 如以上提及的，优选地，关于分析物存在或不存在的信息可以从该EIS数据获得，并且更优选地还可以确定该分析物存在的量。 [0028] 本发明证实，EIS生物传感和区分可以使用有限的频率范围上的少量点（在实例1（见下文）中在十倍程（decade）频率上的七个点）来实现，这能够同时应用含必要频率的多波形式（在实例1中，多正弦）EIS扰动与用来提取必要信息的快速傅里叶变换（FFT）分析。 这样的程序能够使用市售的仪器在几秒内进行测量和分析，从而能够在用于快速且稳健的检测的、现实的时间标度上进行EIS测量。 [0029] 本发明中可以检测任何分析物，并且检测方法取决于所涉及的分析物的类型。一些分析物可以直接结合到电极上，而其他（例如DNA）可以结合到探针上或电极表面上的互补分子上。本发明中采用的这组频率将取决于研究中每个具体系统所出现的结合类型、以及该系统本身的物理性质（电极类型、电极组成、电极尺寸、分析物组成、溶剂/液体介质类型、电解质等等）。对于相似的系统，可以采用标准的频率组，并且对于新的系统或分析物，可以采用实时统计计算，如以上所解释的。 [0030] 本发明进一步提供了一种用于检测分析物的方法，该方法包括： [0031] a)对该分析物施加一个交流电压； [0032] b)确定该分析物上EIS测量值的变化速率； [0033] c)由该变化速率数据确定该分析物的身份和/或量。 [0034] 在本发明的第二方面特别优选的是，这些EIS测量是对电子转移电阻Ret的测量。 对于实时进行的典型EIS测量，一个对探针膜形成和探针-靶标杂交特别灵敏的参数是该 3-/4- 系统中存在的氧化还原对（例如（Fe(CN)6） ）的电子转移电阻Ret。这个参数是本领域公知的、并且可以由EIS谱的尼奎斯特（Nyquist）曲线中的半圆特征的宽度来计算。 [0035] 本发明的这个方面提供了能够进行分析物结合的EIS响应的原位动态测量的IDE测量方案，它是利用电极表面或通过探针-分析物杂交。与采用多重叠加频率相同的是，得到了短得多的EIS测量时间。与第一方面也相同的是，可以检测任何分析物，并且该检测方法的特性将取决于所涉及的分析物的类型。一些分析物可以直接结合到电极上，而其他可以结合到探针上或电极表面上的互补分子上。该Ret数据的准确性将取决于在研究中对每个具体系统所设想的结合类型。 [0036] 如以上已经提及的，在本发明的这个方面，优选的是该氧化还原探针的两种氧化态（例如铁氰酸盐和亚铁氰化物）均存在于溶液中。这确保了在整个方法中IDE处的DC电位被氧化还原探针的还原电位所固定，并且这意味着可以在这两个IDE之间施加电位而不使用外部的参比电极。这能够在IDE中在这两个电极之间容易地施加小幅值的EIS扰动电压以测量EIS响应。这样的测量能够用暴露在溶液中的时间来测量EIS响应。 [0037] 如已经提到的，目前已知的EIS方案测量的是电极/分析物结合（或分析物/探针结合，如在探针附连于电极上的情况下）的平衡过程。这导致EIS信号变化（典型地增加）至一个恒定值，该值代表了平衡。在此情况下，当在溶液中进行测量时，用于平衡的时间以及平衡的EIS信号是实时测定的，从而获得了最优的平衡测量。然而，得出结果时间很慢，因为在可以确定结果之前要求完全的平衡，并且这通常是一个漫长的过程、受到分析物结合和释放速率的控制。在本发明的第二方面，如以上描述的，对该EIS信号的增加速率进行使用和分析以便确定溶液中的分析物浓度；同时在动力学上测量电极/分析物的结合（或探针/分析物的结合）。这能以几分钟或更少的、快得多的TTR来实现，并且不需要达到完全平衡。 [0038] 在本发明中，该EIS数据优选包括从复阻抗(x+iy)获得的数据参数。这些参数是本领域技术人员所公知的并且可以选择以下一项或多项： [0039] 实分量（x） [0040] 虚分量（y） [0041] 模数或绝对值（r=|z|=(x2+y2)1/2） [0042] 角度（θ=tan-l(y/x)） [0043] 主分量1 [0044] 主分量2 [0045] 本发明中采用的叠加频率的数目不受特别限制，只要它们适合于使用EIS分析而在所要求的准确度上给出分析物的身份和/或量。典型地，叠加频率的最小数目是从2到 20。更优选地，叠加频率的最小数目是至少3-10，即，至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10。更优选地，叠加频率的数目是约7。 [0046] 本发明进一步提供了一种用于检测分析物的方法，该方法包括： [0047] a)对该分析物施加一个交流电压； [0048] b)测定该分析物上EIS测量值的变化速率； [0049] c)由该变化速率数据确定该分析物的身份和/或量。 [0050] 在本发明中，所采用的EIS测量的类型不受特别限制。然而，优选地，这些EIS测量是对电子转移电阻Ret的测量。典型地，这些EIS测量是通过在尼奎斯特曲线中找到半圆特征的宽度而计算的测量值，并且总体上Ret可以使用这种途径进行计算。 [0051] 如已经提及的，优选的是本方法在液体介质中进行。优选地对该液体介质进行选择以便辅助这个过程。酸性介质是优选的，并且优选地该液体介质包含H2SO4。 [0052] 以下将参考附图更详细地说明本发明，其中： [0053] 图1示出了来自金粗电极（小Z值）和指叉微电极（IME）的EIS数据的典型尼奎斯特曲线图。 [0054] 图2示出了粗电极和指叉电极二者的阳性对照物和固定探针的数据中实分量（x）、虚分量（y）、模数（r）、角度（θ）、主分量1和主分量2针对频率的曲线。 [0055] 图3示出了来自具有约23秒同时FFT分析的正常单正弦序列EIS测量的金蛋白质粗电极（6700pM抗体）的EIS响应（黑色：两分钟的记录时间；红色：9秒的5次多正弦EIS测量；蓝色：每9秒的15次多正弦EIS测量）。 [0056] 图4示出了具有69-mer HCV DNA探针并且用1mM MCH阻断的改造型金电极（菱形）同与1μΜ互补靶标（ITI 025）的杂交（方形）的尼奎斯特曲线的比较。阻抗测量是在 3- 4- 含10mM（Fe(CN)6） 和10mM（Fe(CN)6） 的2xSSC（加上探针或靶标）中、在IDE对中的这些电极之间施加0V dc电位的情况下进行。 [0057] 图5示出了具有69-mer HCV DNA探针并且用1mM MCH阻断的改造型金电极（菱形）、与1μΜ非互补靶标（ITI 012）杂交（正方形）、与1nM（三角形）和50nM（圆圈）互补 3- 靶标（ITI 025）杂交的尼奎斯特曲线的比较。阻抗测量是在含10mM（Fe(CN)6） 和10mM 4- （Fe(CN)6） 的2xSSC（加上探针或靶标）中、在IDE对中的电极之间施加0V dc电位的情况下进行。 [0058] 图6示出了在探针（硫代DNA）层形成的过程中（棱形）、在用MCH阻断之后（正方形）、在与1μΜ互补靶标杂交的过程中（三角形）、以及在杂交之后洗涤的过程中（圆圈）Ret对时间的EIS测量。 [0059] 图7示出了在互补靶标（50nM）结合和20nM QD培养的EIS测量之后的荧光测量； PMT沉降180。 [0060] 图8示出了阻抗法蛋白酶活性的EIS测量原理图。为了测量一种蛋白酶（例如MMP8或9）的活性，将其对应的底物（肽）固定在电极或适合于测量AC阻抗（A）的装置上。该系统显示出在原理图中以（A）描述的初始阻抗行为。将该系统用含所希望的蛋白酶（B）的样品进行培养将导致所固定的肽的缩短，从而导致变化的阻抗信号，例如在原理图中以（C）表示的减小的Ret值。 [0061] 本发明的这两个方面的方法均具有多个优于已知方法的特定优点：在几秒或几分钟内的、与接近患者的环境要求兼容的快速结果产生时间（TTR）；接近不同探针-靶标系统的宽广适用性；与用于增强的数据收集的快速多正弦EIS的兼容性；EIS检测与电子控制和测量的兼容性；以及无标记的检测。 [0062] 在本方法的这两个方面用于检测的分析物不受特别限制、但优选是一种活质分子。优选地，该分析物是选自细胞、蛋白质、多肽、肽、肽片段、氨基酸、DNA和RNA。本发明的方法对于DNA和RNA检测是特别有用的。 [0063] 本发明的方法可以用于检测单一分析物或同时检测多种不同分析物。 [0064] 优选地，本发明的方法是一种无标记的方法，即，不要求对分析物做标记来辅助检测。然而，在一些情况下可以采用标记物。例如当该方法被用于同时检测多种不同的分析物时，可以用一种或多种对分析物可相关（relatable）的不同标记物来对每种不同的分析物做标记。替代地，可以通过空间分离来检测多组分析物，例如通过将一组用于这些分析物的探针排列在一个表面上。检测多种不同分析物也称为多路技术。 [0065] 在本发明的电化学检测方法中，在液体介质中的溶液中或悬浮体中对分析物进行研究。该液体介质不受特别限制，只要适合于使用EIS进行分析。优选地该液体介质包括一种辅助EIS测量的电解质。该电解质是一种含惰性离子的溶剂或缓冲剂，例如PBS；然后典型地以低得多的浓度添加氧化还原活性物质。该电解质不受特别限制并且可以包括本领域已知的任何电解质。然而，含过渡金属氧化还原体系的电解质是优选的，例如Fe(II)/ 3-/4- Fe(III)电解质体系。（Fe(CN)6） 是特别优选的。 [0066] 如果使用多个不同的标记物来对不同的分析物做标记，则优选地每个标记物具有用于该电化学检测方法的不同的氧化电位，并且因此在所得的数据中产生不同的信号峰。 例如，当使用金属纳米颗粒作为不同分析物的标记物时（见下文），可以对每种分析物使用具有不同氧化电位的不同金属。 [0067] 在优选的实施方案中，对电极施加的交流电位不受具体限制并且取决于所采用的介质。因此在实践中，EIS的最大可能幅值是由溶剂极限固定的（对于水是在2V左右，给出了在1-2V左右的rms幅值）。因此在水性介质中，该电位可以是从+1.0至+2.0V并且优选从+1.2V至+1.8V。当在该体系中使用氧化还原物质时，被氧化和被还原的物质均存在并且这典型地导致使用小于250mV的幅值。在更优选的实施方案中，施加在电极之间的交流电压具有约10mV均方根（rms）的幅值。这使得这种响应能够被线性化，例如用于等效电路分析。可以使用更高幅值的响应（并且如果要采用统计方法来提取特征信号，则它们可以是不同的/有利的）。 [0068] 在一个优选的实施方案中，这种电检测方法是在芯片上进行。在本发明的多路技术实施方案中，其中使用一个或多个标记物用于光学检测，当已经用这些不同标记物同时对一种或多种分析物做标记时，该光学和电学检测可以在一个芯片上进行。替代地，当已经将该一种或多种分析物分离成两等分并且分开做标记时，则可以在做标记之后将它们合并以便在一个芯片上进行光学和电学检测，并且可以在两个分开的芯片上分开地进行光学和电学检测。 [0069] 在本发明的一个实施方案中，该一种或多种分析物是核酸并且该做标记步骤是使用带标记的引物以及使用带标记的核酸的引物延伸来进行的。可以使该带标记的延伸的引物杂交至探针上以便进行光学和电学检测。这是特别有利的，因为它允许该用于电学检测的一个或多个标记物被定位在用于检测的电极的紧密附近。 [0070] 使用EIS，可以通过伏安法来量化存在的分析物的量。由这些信号峰通过积分可以获得定量的数据，即，确定产生的在每个单峰的图下的面积。 [0071] 采用标记法的实施方案 [0072] 在本发明的一些优选实施方案中，采用了标记物，特别是当多路技术是所希望的时候。提及的标记物不受特别限制、但优先选自纳米颗粒、单分子、靶标的固有组分如特定核苷酸或氨基酸、以及化学发光酶。适当的化学发光酶包括HRP和碱性磷酸酶。荧光标记物是特别优选的，因为这些标记物的光学检测容易与本发明的电化学方法进行结合。 [0073] 优选地，这些标记是纳米颗粒。在本发明的这些实施方案中纳米颗粒是特别有利的，因为它们在电学检测方法中成功地运行。纳米颗粒靠近该表面的距离不是特别重要的，这使得化验更加灵活。在一个优选的实施方案中，这些纳米颗粒包括分子的集合，因为这在光学和电学检测方法中与使用单分子相比产生了更大的信号。 [0074] 优选地这些纳米颗粒是选自金属、金属纳米壳、金属二元化合物以及量子点。优选的金属或其他元素的实例是金、银、铜、镉、硒、钯和铂。优选的金属二元化合物和其他化合物的实例包括CdSe、ZnS、CdTe、CdS、PbS、PbSe、HgI、ZnTe、GaAs、HgS、CdAs、CdP、ZnP、AgS、InP、GaP、GaInP、和InGaN。 [0075] 金属纳米壳是球体纳米颗粒，包括被一个薄的金属壳包围的一个内核纳米颗粒。 金属纳米壳的实例是一个硫化金或硅石内核，被一个薄的金壳包围。 [0076] 量子点是半导体纳米晶体，是高度吸光的发光纳米颗粒（West J,Halas N,Annual Review of Biomedical Engineering（生物医学工程年评）,2003,5:285-292“Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications:Improving Sensing,Imaging and Therapeutics工程化纳米材料用于生物光子学应用：改善感测、成像和疗法）”）。量子点的实例包括CdSe、ZnS、CdTe、CdS、PbS、PbSe、HgI、ZnTe、GaAs、HgS、CdAs、CdP、ZnP、AgS、InP、GaP、GaInP、和InGaN纳米晶体。 [0077] 以上标记中的任何一种都可以附连到抗体上。 [0078] 这些标记物的尺寸优选是直径小于200nm、更优选直径小于100nm、还更优选地直径2-50nm、还更优选地直径5-50nm、还更优选地直径10-30nm、最优选为15-25nm。 [0079] 当该方法是用于检测多种分析物时，用一种或多种对分析物可相关的不同标记物来为每种不同的分析物做标记。在本发明的这个方面，这些标记物可以因其组成和/或类型而不同。例如，当这些标记物是纳米颗粒时，这些标记物可以是不同的金属纳米颗粒。当这些纳米颗粒是金属纳米壳时，内核和壳层的尺寸可以改变以便生产不同的标记物。替代地或另外地，这些标记物具有不同的物理特性，例如尺寸、形状以及表面粗糙度。在一个实施方案中，这些标记物可以具有相同的组成和/或类型以及不同的物理特性。 [0080] 用于不同分析物的不同标记物优选在该光学检测方法和电学检测方法中是彼此不同的。例如，这些标记物可以具有不同的发射频率、不同的散射信号和不同的氧化电位。 [0081] 在本发明的采用了标记法的实施方案中，例如在多路技术中，该方法典型地包括另一个初始步骤：将该分析物用一个或多个标记物来做标记以便形成带标记的分析物。 [0082] 用于对分析物做标记的手段不受具体限制并且许多适当的方法是本领域中公知的。例如，当分析物是DNA或RNA时，可以通过结合了标记的引物的酶扩展、在配体或反应位点处的杂交后标记法、或者不带标记的靶标以及标记物-寡核苷酸轭合物探针的“夹心”杂交来做标记（Fritzsche W，Taton T A,Nanotechnology（纳米技术）14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection（金属纳米颗粒作为异相的基于芯片的DNA检测的标记物）”）。 [0083] 在本领域中许多不同的用于将寡核苷酸轭合至纳米颗粒上的方法是已知的，例如，硫醇改性的以及二硫化物改性的寡核苷酸自发地结合到金纳米颗粒的表面上、二硫化物和三硫化物改性的轭合物上、寡硫醇-纳米颗粒轭合物以及来自纳米探针的膦改性纳米颗粒的寡核苷酸轭合物上（见Fritzsche W，Taton T A,Nanotechnology（纳米技术） 14(2003)R63-R73“Metal nanoparticles as labels for heterogeneous,chip-based DNA detection（金属纳米颗粒作为异相的基于芯片的DNA检测的标记物）”中的图2）。 [0084] 在一个实施方案中，DNA或RNA链均可以是生物素酶化的。该生物素酶化的靶标链可以杂交到寡核苷酸探针涂覆的磁珠上。然后链霉抗生素蛋白涂覆的金纳米颗粒可以结合到所捕获的靶标链上（Wang J,Xu D,Kawde A,Poslky R,Analytical Chemistry（分析化学）(2001),73,5576-5581“Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization（基于金属纳米颗粒的电化学汽提电位法检测DNA杂交）”）。这些磁珠允许磁性地去除未杂交的DNA。 [0085] 本发明的EIS方法可以用于许多不同的特定方法中。然而，它们特别适合于蛋白酶检测，例如阻抗法蛋白酶活性检测。图8示出了一个原理图，展示了这可以如何进行操作。为了测量一种蛋白酶的活性，将其底物（具体的肽）固定在电极或适合于测量AC阻抗的装置上（A），例如在本发明的方法中使用的装置上。该系统显示出在原理图中以（A）描述的初始阻抗行为。将该系统用含所希望的蛋白酶（B）的样品进行培养将导致所固定的肽的缩短，从而导致变化的阻抗信号，例如在原理图中以（C）表示的减小的Ret值。在这种类型的安排中，有可能以法拉第模式和非法拉第模式（有和没有介导物质，例如亚铁/铁氰化物）运行该系统。 [0086] 本发明的这个方面的优点是，在测试中不需要引入额外的试剂来测量蛋白酶活性。该系统具有的电位将被多路传送，因为可以在同一样品和反应空间内测量许多蛋白酶。 该系统还潜在地比常规系统快得多，因为能以多路传送的方式进行动力学阻抗测量。 [0087] 可以检测任何蛋白酶，并且蛋白酶的类型不受特别限制。然而在一些实施方案中，采用了与伤口相关的蛋白酶。典型地，这些蛋白酶是在没有愈合的伤口中存在的蛋白酶。特别感兴趣的两种蛋白酶是MM8和MM9。 [0088] 下面仅以举例方式进一步描述本发明。 [0089] 实例 [0090] 实例1——研究多频率分析的IES参数 [0091] 为了研究将在本发明的第一方面的方法中使用的最优参数，可以采用任何EIS装置。然而，典型地将采用在最终分析中会涉及到的电极、电解质、液体介质、分析物（以及探针，如果要使用的话）以便确保这些参数尽可能接近最佳值。 [0092] 在这个实例中，研究了在来自艾伯泰科公司（Abtech）的商业金IDE上的探针-靶标杂交。采用一个电化学清洁循环，对该IDE对中的两个电极施加针对在50mM H2SO4水溶液中的Ag/AgCl在-0.6V与+1.65V之间的线性电位扫频，以50mV的扫频速率进行30-40个完全循环，直到看见干净金电极的稳定循环伏安图（CV）特征。在制备该DNA（69-mer ITI 021）溶液之前，将这些DNA探针通过使之在用5mM TCEP溶液裂解二硫化物保护的核苷酸之TM 后穿过MicroSpin G-25柱（安莫斯汉姆生物科学公司（Amersham Biosciences），英国白金汉郡）而进行纯化。 [0093] 将这两个金粗电极和指叉微电极（IME）的EIS大频率范围的尼奎斯特曲线绘制出来，并且它们显示在图1中；每个显示了互补靶标结合的独特信号。 [0094] 将阳性对照（结合了互补靶标的探针）与阴性对照（仅探针或带有非互补靶标的探针）之间的差异在从复阻抗获得的参数的意义上进行比较，该复阻抗可以写为x+iy，其中i 1/2 是(-1) 。它们是： [0095] 实分量（x） [0096] 虚分量（y） [0097] 模数或绝对值（r=|z|=(x2+y2)1/2） [0098] 角度（θ=tan-1(y/x)） [0099] 主分量1 [0100] 主分量2 [0101] 通过将这些量针对频率的对数绘制成曲线而就每个量来研究这些差异（见图2）。 [0102] 图2显示，对于大的（粗）电极和小的（指叉微）电极二者，实分量和模数提供了相似的信息并且最好地将EIS信号与阳性对照和固定探针进行了区分，特别是在该频率范围的下端处。虚分量最好地区分了在该频率范围的中间的EIS信号。 [0103] 为了优化该TTR，本发明选择了最有用的频率范围以及最小的测量次数，这些对所有实验条件下的不同EIS数据进行了最好的区分、并且不要求采用拟合模型，如等效电路。 这个实例中的统计分析通过使用阳性对照与固定探针的EIS信号之间的倍数变化而对金粗电极和指叉微电极（IME）二者均确定了一种7点式的最佳频率范围。 [0104] 结果总结在表1中。 [0105] 表1：基于互补杂交对比无靶标对照的固定探针的、金粗电极和指叉微电极的7点最佳频率范围（以Hz计）的结果总结 [0106] [0107] 值得注意的是，对于这两个类型的电极，模数数据和实分量对EIS测量给出了非常相似的最佳频率范围，跨过了十倍程的频率。对于这两个类型的电极，虚分量在比实分量和模数数据略微更高的频率处给出了最佳信号，在此跨过了十倍程的频率。从粗到IME的电极尺寸的非常大的变化对测量的最佳频率范围具有极小的影响，这与响应在很大程度上独立于电极面积是一致的，从而简化了EIS测量。使用倍数变化进行互补对比模拟（mock）杂交的差示分析给出了与互补杂交对比固定探针信号类似的最佳频率范围（表2），证明可以使用相同的测量范围。 [0108] 表2：基于互补对比模拟杂交比较的金粗电极的7点最佳频率范围，以Hz计[0109] 信号类型 点的数目 最佳范围 模数 7 （4,44） 实分量 7 （3,30） 虚分量 7 （20,255） [0110] 为了能够快速获得这些数据，已经采用多正弦技术来同时施加所需的多个频率，用FFT分析结果并提取这些数据。图3示出了对于蛋白质粗电极实验系统，之前使用的对于所测响应依次施加单正弦的方法对于5个多正弦（在十倍程频率上）与15个多正弦（在二十倍程频率上）EIS测量所得到的EIS尼奎斯特曲线的对比。实验数据的收集、分析和展示是在PC上在几分钟的依次施加时间内进行，对于5个正弦是在7秒左右并且对于15个正弦是在23秒左右。这个多正弦实验的分量频率已经选择为跨过通过统计分析确定的频率范围，该频率范围跨过了所示的EIS尼奎斯特曲线中的半圆形电荷转移特征。所有数据极近的一致性（典型地在0.05%内）表明，多正弦EIS途径得到了与EIS测量和分析兼容的、在几秒内的更快速的EIS参数提取（并且因此得到了几秒内的TTR），而不损害测量准确性。 [0111] 实例2——研究使用EIS的实时动力学测量 [0112] 在这个实例中，研究了在来自艾伯泰科公司的商业金IDE上的探针-靶标杂交的动力学。采用一个电化学清洁循环，对该IDE对中的两个电极施加在针对在50mM H2SO4水溶液中的Ag/AgCl的-0.6V与+1.65V之间的线性电位扫频，以50mV的扫频速率进行30-40个完全循环，直到看见干净金电极的稳定循环伏安图（CV）特征。在制备该DNA（69-mer ITI021）溶液之前，将DNA探针通过使之在用5mM TCEP溶液裂解二硫化物保护的核苷酸之TM 后穿过MicroSpin G-25柱（安莫斯汉姆生物科学公司（Amersham Biosciences），英国白金汉郡）而进行纯化。 [0113] 在清洁之后立即将硫醇-DNA探针层在室温下浸没在处于2xSSC缓冲剂和 3- 4- 3-/4 （Fe(CN)6） 与（Fe(CN)6） 各l0mM（10mM（Fe(CN)6） -）中的10μΜ DNA溶液中。一旦将电极浸没在该DNA溶液中就开始EIS测量并使其运行3-4h。同之前一样，在该IDE对的电极之间施加10mV RMS幅值的正弦波电压，贯穿这些实验是在0V的DC电压下，因为存在相 3- 4- 3-/4- 等浓度的（Fe(CN)6） 和（Fe(CN)6） 确保了每个电极的DC电位被固定在（Fe(CN)6） 的还原电位下。然后，将被改性的表面用2xSSC洗涤几分钟并在室温下用水中的MCH 1mM阻 3-/4- 断30分钟。在2xSSC缓冲剂中洗涤10-20分钟之后，再次在10mM（Fe(CN)6） 2xSSC缓冲剂中测量电极的EIS信号以便检查阻断步骤之后的变化。然后将这些电极浸没在被溶解 3-/4- 于2xSSC中并且含有10mM（Fe(CN)6） 的靶标（互补的或不是互补的）DNA中，以允许进行EIS测量，再次是在0V DC下。 [0114] 图4示出了这些69-mer硫醇-DNA改性的探针电极在与1μΜ互补靶标（ITI 025）杂交之前和之后的典型阻抗曲线。高频率半圆是粗电极以及IDE电极二者的共同特征、并且给出了在电极表面处穿过探针膜层的电荷转移的信息。在添加1μΜ互补靶标之后，由于互补靶标-探针在探针层中的结合，这个高频率半圆的直径如所预期的增大，而低频率扩散特征基本上保持不变，表明（如所预期的）对电极之间的扩散具有极小的影响。 [0115] 图5示出了以相同方式制备的IDE的另一个实例。在此情况下，在阻断之后进行 3-/4- 阴性对照：在含有1μΜ非互补（ITI 012）靶标和10mM（Fe(CN)6） 的在2xSS中的溶液中监控EIS，持续几小时。如预期的，在阻抗信号上没有观察到改变，表明没有非互补靶标-探针的结合。此后将该电极在2xSSC缓冲剂中漂洗，并在1nΜ互补靶标DNA和10mM 3-/4- （Fe(CN)6） 在2xSSC中的溶液中测量响应值。1h后，当响应稳定时，将该电极浸没在50nM靶标溶液中并过夜测量。探针与1nM靶标之间的差异很小但是显著的，而对于50nM是容易看见的。因此EIS使用所建立的等待平衡方法来探测互补靶标的结合。 [0116] 现在，图6示出了实时进行的典型EIS测量：对探针膜的形成和探针-靶标的杂交 3-/4- 而言灵敏的参数是（Fe(CN)6） 的电子转移电阻Ret，已经通过在每个EIS谱的尼奎斯特曲线中寻找半圆特征的宽度而计算了该参数。已经在该图中将其作为时间的函数绘制成曲线（作为电子转移的Ret）。 [0117] 这些数据含有丰富的信息并且显示了探针膜的建立（棱形）、阻断和洗涤（正方形）以及探针-靶标杂交的动力学（三角形）。当将该金电极暴露于探针膜溶液中时（棱形），由于探针膜的形成，Ret值在第一个小时左右升高，而接着在3-4小时后下降至稳定状态，表明了稳定的表面膜。这是通过移除探针溶液并洗涤而确认的，因为所观察的值具有极小的变化。加入巯基己醇（MCH）来阻断任何剩余的金表面同样对电阻造成极小改变，如同在具有 3-/4- （Fe(CN)6） 的缓冲剂（正方形）中随时间测量该电阻所造成的一样，这再次表明了稳定的探针膜。已经建立了稳定的探针膜后，使用动力学技术来监控在该含有互补靶标和亚铁/铁氰化物的溶液中探针-靶标的结合。在将该探针膜暴露于这个溶液中时（三角形），看到了由于互补靶标-探针的结合导致的Ret值的立即增大。这种初始响应是立即的，其中第一点显示了Ret的增大并且其值远大于第一小时内的双倍。这个方法能够每隔几秒就在动力学方面测量EIS响应（见多正弦IDF）。典型地预计探针-靶标结合的增大速率是在（并且当然依赖于）靶标浓度的一阶；因此对EIS升高速率的分析有可能在几秒到几分钟的时间量程上就给出靶标浓度。令人满意的是阻抗在此后的几小时内更缓慢地增大，显示了达到平衡响应的较长时间，这限制了平衡测量的TTR。在移除该靶标溶液、洗涤并然后测量具有 3-/4- （Fe(CN)6） 的缓冲剂（圆圈）中的响应时，在Ret的瞬时变化之后，该值初始地回到先前观察到的值，显示这种响应表明了探针-靶标的结合。 [0118] 为了证明在金电极上发生了探针层的形成以及杂交，使用以卵白素做标记的靶标并然后用以链霉抗生素蛋白做标记的Q点（在QD缓冲剂中为20nM）进行培养（在室温下持续1h）。 [0119] 从所得的荧光照片（图7）中很清楚，如所预期的，最高荧光强度的区域是在IDE的金指状物上。这证明在杂交之后观察到的Ret的增加是由于在金IDE表面的膜中的探针-靶标杂交。