技术领域
[0001] 本发明涉及利用被荧光色素标识化的荧光微球所发出的荧光识别微球种类的荧光检测方法、被荧光色素标识化的荧光微球的制备方法以及被荧光色素标识化的荧光微球。
相关背景技术
[0002] 在医疗、生物领域中所使用的流式细胞仪中，通过向荧光微球照射激光，检测出与活体物质相结合的荧光微球所发出的荧光，根据该荧光，识别该活体物质所结合的荧光微球的探头的种类。在此，在荧光微球中，探头（具有互补序列的基因片段或与特定蛋白质结合的抗体等具有选择性结合功能的物质）设置在表面上。
[0003] 具体地说，在流式细胞仪中如下形成流动池：在细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质等以被规定的荧光色素标识化的状态下被包括的悬浮液中，作为荧光试剂，混合被可识别的荧光色素染色而被标识化的荧光微球，然后，施加压力使荧光微球在以每秒大约10m速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成流动池。通过朝向该流动池中的荧光微球照射激光，由此接收荧光微球所发出的荧光和与该荧光微球结合的活体物质所发出的荧光。另外，通过将荧光微球的荧光从这些荧光中作为标识进行识别，由此能够特定该活体物质所结合的探头的种类。
[0004] 尤其是，在不同荧光微球中设置不同种类的探头，以按照不同的探头种类能够用不同荧光色素识别的方式染色荧光微球，由此能够调查活体物质与哪种探头结合的情况。在这种情况下，需要将具有各种探头的多个荧光微球混合到含有活体物质的悬浮液内并在流式细胞仪中短时间内一次性地进行分析。
[0005] 然而，作为现有技术的荧光检测方法，已公开有利用被荧光色素染色且表面上设有探头的微球所发出的荧光，识别微球种类的方法（专利文献1）。在该方法中，微球被预先对荧光弛豫时间不同的两种荧光色素进行混合的物质染色，利用该微球进行荧光检测时，通过检测微球的荧光并测量荧光弛豫时间，由此识别微球的种类。
[0006] 专利文献1：特许第4300366号公报
具体实施方式
[0057] 下面，详细说明本发明的荧光检测方法、荧光微球的制备方法以及荧光微球。
[0058] 图1为实施本发明的荧光检测方法的流式细胞仪10的概略构成图。
[0059] 流式细胞仪10是，使包含荧光微球12以及活体物质13的样品S与鞘液一起流动，并将以规定频率进行强度调制的激光照射至通过测量点的样品S，并接收此时样品S所发出的荧光，由此检测荧光。
[0060] 荧光微球12为具有几μm程度的直径的球体，并且包含合成荧光色素。荧光微球12在其表面上与合成荧光色素的种类相对应具有不同的探头。合成荧光色素与合成荧光色素的种类相对应，其荧光强度以及荧光弛豫时间相互不同。即，荧光微球12在每个探头上被合成荧光色素标识化。合成荧光色素是使荧光强度、荧光波长以及荧光弛豫时间相互不同的基本荧光色素A~D的比率相互不同，进一步，使基本荧光色素A~D的绝对含量相互不同而制备的色素。
[0061] 另外，活体物质13包含荧光蛋白等荧光色素，并且被标识化。
[0062] 流式细胞仪10包括信号处理装置（荧光检测装置）20和分析装置80。
[0063] 信号处理装置20将激光照射至形成流动池的样品S上，并接收样品S中的荧光微球12的荧光色素发出的荧光和与荧光微球12的探头结合的活体物质13的荧光色素发出的荧光，由此对从光电转换器输出的荧光信号进行信号处理。
[0064] 分析装置80根据信号处理装置20中得到的处理结果，对与荧光微球12的探头结合的活体物质进行分析。
[0065] 另外，在本实施方式中，作为探头使用具有与DNA、抗体等活体物质结合的性质的物质（进行特异性结合的物质），但在本发明中，除此之外还可以使用相对于PH或氧化还原电位等测量环境情况广泛地反应的物质，并且并不局限于此。
[0066] 信号处理装置20包括激光光源部22、受光部24、26、控制和处理部28、管道30。
[0067] 控制和处理部28包括：控制部，以规定频率对从激光光源部22发射的激光进行强度调制；信号处理部，对样品S发出的荧光信号进行信号处理。在管道30中，使样品S包括在形成高速流的鞘液中，由此形成流动池。
[0068] 在管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10中也可以配置细胞分类器，其用来通过激光照射在短时间内从其它活体物质13或荧光微球12分离出与样品S中的荧光微球12结合的活体物质13，从而将其分离于各自的回收容器中。
[0069] 激光光源部22发射两束不同波长的激光。透镜系统按照使激光聚焦在管道30中的规定位置的方式设置，并在该聚焦位置上形成样品S的测量点。
[0070] 图2为表示激光光源部22构成的一个例子的图。
[0071] 激光光源部22发射具有可见光区域波长且以规定频率进行强度调制的激光。
[0072] 激光光源部22包括光源22a和光源22b。光源22a照射具有基本荧光色素A和基本荧光色素B的光吸收波段以及活体物质13的荧光色素的光吸收波段波长的激光。因此，使用基本荧光色素A和基本荧光色素B制备的合成荧光色素以及附着在活体物质13的荧光色素在规定的波段以规定的荧光强度和规定的荧光弛豫时间发出荧光。
[0073] 光源22b照射具有基本荧光色素C和基本荧光色素D的光吸收波段波长的激光。因此，使用基本荧光色素C和基本荧光色素D制备的合成荧光色素在规定的波段以规定的荧光强度和规定的荧光弛豫时间发出荧光。
[0074] 进一步，激光光源部22包括分色镜23a、透镜系统23b、激光驱动器34a以及34b。另外，可以用半透明反射镜来代替分色镜23a。
[0075] 分色镜23a透射特定波段的激光，反射其它波段的激光。透镜系统23b将由激光L1和L2构成的激光L1＋L2聚焦在管道30中的测量点上。激光驱动器34a分别驱动光源22a和光源22b。
[0076] 作为发射这些激光的光源，可以使用例如半导体激光器。激光L的输出功率是例如约5~100mW。
[0077] 另外，在对激光L1和L2进行强度调制中所使用的频率（调制频率），其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如为10~50MHz。对激光L1和L2进行强度调制所用的频率不同。这么做的目的是，通过被激光激发的样品S所发出的荧光的频率也相互不同，知道是被哪束激光激发的荧光，由此分离荧光信息。
[0078] 分色镜23a透射激光L1且反射激光L2的反光镜。通过这样的构成合成激光L1和激光L2，使其作为照射至测量点的样品S的一束照射光。
[0079] 光源22a、22b按照预先规定的波段振荡，使得激光L1、L2激发荧光色素而发出特定波段的荧光。当被激光L1、L2激发的样品S通过管道30的测量点时，在测量点受到激光L1、L2照射，由此荧光微球12以及/或活体物质13发出以规定波长发出荧光。
[0080] 受光部24按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置，并且包括光电转换器，通过激光因通过测量点的样品S而发生前向散射，由此输出样品S通过测量点情况的信号。从该受光部24输出的信号被供给到控制和处理部28以及分析装置80，用作通知样品S通过管道30中的测量点的时间的触发信号、处理开始的ON信号、OFF信号。
[0081] 另一方面，受光部26配置在相对于从激光光源部22发射的激光发射方向垂直的方向且相对于管道30中样品S的移动方向垂直的方向，并包括多个光电转换器，以用来接收样品S在测量点被激光照射后发出的荧光。图3为表示受光部26的一个例子的概略构成的概略构成图。
[0082] 图3所示的受光部26包括：对来自样品S的荧光信号进行聚焦的透镜系统26a、分色镜26b1、26b2、带通滤波器26c1、26c2、26c3、光电倍增管等光电转换器（受光元件）27a、27b、27c。
[0083] 透镜系统26a按照使入射至受光部26的荧光在光电转换器27a、27b、27c的受光面上聚焦的方式构成。
[0084] 分色镜26b1、26b2是反射规定范围波段的荧光且透射除此之外荧光的反光镜。按照通过带通滤波器26c1、26c2、26c3进行过滤，通过光电转换器27a、27b、27c捕获规定波段的荧光的方式，设定分色镜26b1、26b2的反射波段和带通滤波器26c1、26c2、26c3的透射波段。
[0085] 带通滤波器26c1、26c2、26c3是设置在各光电转换器27a、27b、27c的受光面前面，且仅透射规定波段的荧光的滤波器。透射的荧光的波段设定为与基本荧光色素A~D所发出的荧光和活体物质13的荧光色素所发出的荧光的波段对应的波段。具体地说，波段被设定为：波段R1，用来主要接收通过从光源22a发射的激光L1的照射而荧光微球12的荧光色素发出的荧光；波段R2，用来主要接收通过从光源22b发射的激光L2的照射而荧光微球12的荧光色素发出的荧光；波段R3，用来主要接收通过从光源22a发射的激光L1的照射而活体物质13的荧光色素发出的荧光。波段R1包含被激光L1照射的样品S中包含基本荧光色素A和基本荧光色素B而被制备的合成荧光色素所发出的荧光的波长。波段R2包含被激光L2照射的样品S中包含基本荧光色素C和基本荧光色素D而被制备的合成荧光色素所发出的荧光的波长。
[0086] 光电转换器27a、27b、27c是包括例如光电倍增管等传感器、且将在光电面接收的光转换成电信号的受光元件。在此，所接收的荧光是基于以规定频率进行强度调制的激光激发的荧光，因此所输出的荧光信号也是以规定频率对其强度进行变动的信号。将该荧光信号供给至控制和处理部28。
[0087] 如图4所示，控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42、信号控制部44。
[0088] 信号生成部40是生成用来以规定频率对激光L1、L2强度进行调制的调制信号的部分。
[0089] 具体地说，信号生成部40包括振荡器46a、46b、功率分配器48a、48b以及放大器50a、50b、52a、52b、52c。信号生成部40将所生成的调制信号供给到激光光源部22的激光驱动器34a、34b，同时将调制信号供给到信号处理部42。如后述，将调制信号供给到信号处理部42是用作对从光电转换器27a、27b、27c输出的荧光信号进行检波的参照信号。另外，调制信号是DC成分上载有规定频率的正弦波信号的信号，其频率范围设定成10MHz~50MHz。
振荡器46a和振荡器46b振荡相互不同的频率f1、f2的信号，并生成不同频率的调制信号。
另外，在本实施方式中作为调制信号使用相互不同的频率f1、f2的信号，但如果用带通滤波器26c1、26c2、26c3能够充分地分离所要测量的荧光，则频率f1、f2没必要不同，可以相同。
[0090] 进一步，振荡器46a、46b还可以按照其频率f1、f2自由变更的方式构成。另外，带通滤波器26c1、26c2、26c3还可以利用根据所使用的荧光微球12的种类能够变更透射波段的可变滤波器。
[0091] 信号处理部42是利用输出自光电倍增管27a、27b、27c的荧光信号提取通过激光照射所发出的荧光的荧光强度以及相位滞后信息。信号处理部42包括：放大器54a、54b、54c，其放大从光电转换器27a、27b、27c输出的荧光信号；IQ混频器58a、58b、58c，将从信号生成部40供给的正弦波信号的调制信号作为参照信号，与放大的各个荧光信号进行合成；
低通滤波器62。
[0092] IQ混频器58a、58b、58c是将从光电倍增管27a、27b、27c供给的荧光信号与从信号生成部40供给的调制信号作为参照信号进行混合的装置。具体地说，各IQ混频器58a、58b、58c将参照信号与荧光信号（RF信号）相乘，并生成荧光信号的包括与调制信号相位相同的成分的信号和荧光信号的包括相对于调制信号相位90度位移的成分的信号。包括相位相同的成分的信号是通过将调制信号和荧光信号进行混合而生成，包括相位90度位移的成分的信号是通过将相对于调制信号相位90度位移的信号和荧光信号进行混合而生成。
[0093] 低通滤波器62是过滤在IQ混频器58a、58b、58c中生成的信号的低频信号的部分。通过该过滤，与调制信号相位相同的荧光信号的成分（Re成分）和相对于调制信号相位90度位移的荧光信号的成分（Im成分）作为荧光数据被提取。被提取的各成分送至信号控制部44。Re成分和Im成分是在光电转换器27a、27b、27c上设定的各波段R1、波段R2以及波段R3上获得，因此波段R1的Re成分以及Im成分的组和波段R2的Re成分以及Im成分的组和波段R3的Re成分以及Im成分的组被送至信号控制部44。下面，将包括通过IQ混频器58a、58b、58c的混合处理和通过低通滤波器62的过滤处理称之为频率下降转换处理，将通过该处理得到的数据称之为荧光数据。
[0094] 信号控制部44是将从信号处理部42发送来的荧光信号的Re成分和Im成分放大并进行AD转换的部分。
[0095] 具体地说，信号控制部44包括：系统控制器60，下达指令以控制各部分的动作，同时管理流式细胞仪10的整个动作；放大器64，将从信号处理部42生成的Re成分和Im成分放大；A/D转换器66，将被放大的Re成分和Im成分抽样。
[0096] 分析装置80从在信号控制部44通过A/D转换得到的Re成分和Im成分计算出荧光色素发出的荧光的荧光强度。进一步，分析装置80计算出相对于激光的强度调制的荧光的相位滞后角度，进一步，从该相位滞后角度计算出荧光弛豫时间常数（荧光弛豫时间）和荧光强度。图5为表示分析装置的概略构成的图。
[0097] 分析装置80由包括CPU82和存储器84的计算机构成，进一步包括荧光强度计算部90、相位滞后计算部92、荧光弛豫时间计算部94、样品分析部96。这些部分是计算机上通过启动软件而使其发挥功能的软件模块。当然，这些部分可以由专用电路构成。
[0098] 荧光强度计算部90针对从A/D转换器66供给的荧光数据，通过计算出复数的绝对值来计算出荧光强度。
[0099] 相位滞后计算部92针对从A/D转换器66供给的荧光数据，将Re成分作为实数-1部、将Im作为虚数部的复数的辐角（tan （荧光数据的Im成分/荧光数据的Re成分））作为相位滞后角θ计算出。
[0100] 荧光弛豫时间计算部94是利用在相位滞后计算部92计算出的θ，根据公式τ＝1／（2πｆ）·ｔａｎ（θ）计算出荧光弛豫时间τ的部分。在此，f为用于对激光L1或激光L2进行强度调制的频率。能够根据公式τ＝1／（2πｆ）·ｔａｎ（θ）计算出荧光弛豫时间τ是由于荧光现象表示根据一次弛豫过程的变化。
[0101] 样品分析部96利用所计算出的荧光强度、荧光弛豫时间τ，分析活体物质13与哪种荧光微球12结合。样品分析部96将分析结果和分析用的数据或图表输出在打印机或显示器等输出装置上。
[0102] 具体地说，样品分析部96根据荧光强度、荧光弛豫时间以及荧光波段识别荧光微球12所发出的荧光，进一步，识别活体物质13所发出的荧光。此时，样品分析部96通过所识别的荧光来识别荧光微球的种类时，判断是否同时接收活体物质13发出的荧光。进一步，样品分析部96接收活体物质13发出的荧光时，判断同时接收哪种荧光微球12发出的荧光。
[0103] 由此，能够知道活体物质13与哪种荧光微球12结合，从而能够分析活体物质13的特性。
[0104] 图6（a）为表示在波段R1中测量的荧光的荧光强度的频率分布曲线和荧光弛豫时间的频率分布曲线的一个例子的图。图6（b）为表示在波段R2中测量的荧光的荧光强度的频率分布曲线和荧光弛豫时间的频率分布曲线的一个例子的图。
[0105] 在波段R1中测量荧光微球12发出的四种荧光a~d。荧光微球12包括基本荧光色素A、D的含有比例和绝对含有量不同的多个种类，多个种类分别发出不同的荧光。在波段R1中，荧光a~d的荧光强度和荧光弛豫时间不同，从如图6（a）所示的频率分布曲线能够识别出四种荧光。即使在图6（a）中的荧光a、d的荧光弛豫时间相邻的情况下，荧光强度的频率分布曲线中荧光a、d的分布充分分离，因此能够分离荧光a、d而进行识别。
[0106] 在波段R2中也测量荧光微球12发出四种荧光α~δ。在波段R2中荧光α~δ的荧光强度和荧光弛豫时间不同。因此，从图6（b）所示的频率分布曲线能够识别四种荧光。即使在图6（b）中的荧光β、γ的荧光弛豫时间相邻的情况下，荧光强度的频率分布曲线中荧光β、γ的分布充分分离，因此能够分离荧光β、γ而进行识别。
[0107] 在波段R3中测量活体物质13发出的荧光。从图6（c）所示的频率分布曲线能够识别出荧光。
[0108] 图6（d）是为了看到波段R1的荧光强度P和波段R3的荧光强度P的对应关系而将荧光强度P的数据进行标点的散布图。图6（e）是为了看到波段R1的荧光弛豫时间τ和波段R3的荧光弛豫时间τ的对应关系而将荧光弛豫时间τ的数据进行标点的散布图。
[0109] 在图6（d）中表示得到波段R1中的荧光强度Pc的荧光数据时同时得到波段R3中的荧光强度Px的荧光数据的情况。在图6（e）中表示得到波段R1中的荧光弛豫时间τc时同时得到波段R3中的荧光弛豫时间τx的荧光数据情况。
[0110] 因此，在本实施方式中，当测量荧光微球12发出的荧光时，通过识别是否同时得到波段R3中的荧光弛豫时间τx的荧光数据，能够特定活体物质13与荧光微球12中的哪种荧光微球12容易结合。
[0111] 如上所述一样，在本实施方式中，如图6（a）所示，用波段R1、R2和荧光强度和荧光弛豫时间的三个识别因子实现发出相互不同种类荧光的荧光微球12。这样的多种荧光微球12能够通过如下的方式实现，例如用使荧光强度和荧光弛豫时间相互不同的两种基本荧光色素A、B的比率和基本荧光色素A、B的绝对含有量相互不同的三种以上的合成荧光色素标识化而实现。在本实施方式中，使用了两种基本荧光色素A、B，但可以使用三种以上的基本荧光色素。
[0112] 例如，在如下设定荧光微球12的种类时，即，将荧光微球12的波段分为两种（波段1、波段2），在波段1和波段2接收荧光微球12发出的多个荧光以计算各荧光的荧光强度和荧光弛豫时间时，将荧光弛豫时间在波段1中设定为五种，在波段2中也设定为五种，将荧光强度在波段1中设定为五种，在波段2中也设定为五种，此时能够用流式细胞仪10识别的荧光微球12的合计种类为625种（=5×5×5×5）。即，通过使波段1中的基本荧光色素和波段2中的基本荧光色素包含在荧光微球12上，荧光微球12利用波段1和波段2的双方的测量结果进行识别而获得。在该情况下，优选的是，诸如波段1和波段2为450nm~500nm的短波段和600nm~650nm的长波段，荧光的波段相互分离。
[0113] 另外，基本荧光色素为两种时，当使各基本荧光色素的荧光强度为F1和F2，荧光弛豫时间为τ1和τ2，基本荧光色素的比率为x（x为小于1的正数）和（1－x），根据绝对含有量确定的参数（前指数因子）为α1和α2时，被制备的三种以上的荧光微球优选的是按照由下述式（1）规定的荧光强度F、以及由下述式（2）规定的荧光弛豫时间τ相互不同的方式设定上述比率和上述绝对含有量。
[0114] F=α1×τ1×x +α2×τ2×(1-x) （1）
[0115] τ=｛α1×τ12×x+α2×τ22×(1-x)｝/F （2）
[0116] 常数α1和α2是根据绝对含有量确定的值，绝对含有量越大常数也越大。因此，通过使绝对含有量大来能够使合成荧光色素发出的荧光的荧光强度大。另外，荧光弛豫时间即使是常数α1和α2大，但根据比率x、（1－x）变化。因此，能够独立地设定荧光强度和荧光弛豫时间。
[0117] 另外，荧光微球12例如如下地制备。即，当设定荧光强度、荧光波长以及荧光弛豫时间相互不同的至少两种基本荧光色素的比率和两种基本荧光色素的绝对含有量时，按照根据所述比率和所述绝对含有量获得的合成荧光色素的荧光强度以及荧光弛豫时间与基本荧光色素的荧光强度以及荧光弛豫时间都不同，并且与其它合成荧光色素的荧光强度以及荧光弛豫时间也不同的方式设定比率和绝对含有量。然后，由使用通过已设定的所述比率以及所述绝对含有量而得到的合成荧光色素对荧光微球12进行标识化。例如，荧光微球12的表面上涂布合成荧光色素。或者，使合成荧光色素包含在荧光微球12的材料自身，该材料成形为球状。
[0118] 基本荧光色素为两种的情况下，当将各基本荧光色素的荧光强度设定为F1和F2、将荧光弛豫时间设定为τ1和τ2、将基本荧光色素的比率设定为x（x为小于1的正数）和（1－x）、将根据绝对含有量确定的常数设定为α1和α2时，合成荧光色素的荧光强度F以及荧光弛豫时间τ可以根据上述式（1）和（2）确定。
[0119] 以上，详细说明了本发明的荧光检测装置、荧光检测方法以及对荧光信号进行信号处理的方法，但本发明并不局限于上述实施方式，在不脱离本发明主要内容的范围内可以进行多种改进或变更。
