技术领域 本发明涉及生物凝胶，和用于形成该生物凝胶的试剂盒、制剂和 方法。在优选的方面，该生物凝胶是组织粘合剂。可以将该生物凝胶 或组织粘合剂用于包括止血、封闭伤口愈合、组织工程或定位的药物 递送的多种应用。 背景技术 在凝血过程中，通过凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。纤维 蛋白原包含彼此通过二硫键连接的两组三个不同链(α、β和γ)。 这些链一起形成与两个远端球状结构域(D结构域)相连的中心球状 结构域(E结构域)。凝血酶切割在纤维蛋白原中心E结构域中的四 个精氨酸-甘氨酸肽键，从两个α链中的每一个的释放A肽，且从两 个β链中的每一个均释放B肽。将A和B肽命名为纤维蛋白肽。缺乏 这些纤维蛋白肽的纤维蛋白原分子被称为纤维蛋白单体。纤维蛋白单 体自发的组装为称为纤维蛋白的有序纤维阵列。通过在纤维蛋白纤维 中不同分子侧链之间形成共价交联来稳定纤维蛋白。在转酰胺基反应 中在特定谷氨酰胺和赖氨酸侧链之间形成肽键，该反应由因子XIIIa 催化。 一旦被激活，血小板也参与形成血块的基本部分。血小板附着到 暴露的伤口表面和被激活。血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa经历构象的改 变，使其结合纤维蛋白原。纤维蛋白原能够结合多个血小板，从而使 血小板凝聚在一起。血小板凝聚形成在纤维蛋白网络内所形成血块的 基本结构。 纤维蛋白组织粘着剂(FTA)是对通过模拟凝血连锁反应最后步骤 所形成产物的命名，使用该凝血连锁反应以形成纤维蛋白凝块。商品 化的FTA试剂盒快速产生强的生物可降解凝胶，其被用于止血、药物 递送和作为外科胶和组织塑封。通常经由注射装置递送纤维蛋白原、 因子XIII、凝血酶和钙离子，在贮存期间该装置将纤维蛋白原和因子 XIII与钙离子和凝血酶分开。在从注射器释放期间组分被混合，导致 纤维蛋白原的溶栓，产生纤维蛋白，其自组装形成凝胶，之后通过钙 离子激活的因子XIII被交联。但是，许多FTA使用牛凝血酶，其可以 在患者中诱发过敏反应和自身免疫反应。 Zhang等人(Bioconjugate Chem.2002(13)：640-646)描述了基 于纤维蛋白原的水凝胶的形成，该过程是通过光激活从脂质体释放钙 离子，随后激活谷氨酰胺转移酶催化纤维蛋白原交联。但是，这些水 凝胶的形成是复杂的，并且需要专门形成脂质体和因子XIII。 Hidas等人(Urology 67(4)，2006：697-700)描述了白蛋白戊二 醛组织粘合剂在无缝合肾保留手术中的用途。将牛血清白蛋白和戊二 醛混合。戊二醛暴露导致牛血清白蛋白的赖氨酸分子、细胞外基质蛋 白和细胞表面彼此结合，产生强共价键。但是，这一粘合剂的缺点在 于，戊二醛是有毒的，和具有牛血清白蛋白可能在患者中诱导过敏反 应的风险。 因此，需要提供凝胶或组织粘合剂，其不需要使用毒性物质，最 小化过敏反应的风险，并且其可以容易地从能够在稳定条件下容易贮 存的成份中产生。 发明内容 根据本发明，提供生物试剂盒(即，用于形成生物凝胶的试剂盒)， 其包含：多个载体、固定于各载体上的多个纤维蛋白原结合部分和纤 维蛋白原，其中各纤维蛋白原分子能够结合至少两个纤维蛋白原结合 部分。 本文使用的术语“生物凝胶”包括包含一种或多种成份的凝胶， 所述成份是天然或重组的生物分子(或化学合成的生物分子)、或其衍 生自生物分子(例如，保留生物分子的一种或多种功能的衍生物)。 可以通过将纤维蛋白原和载体接触形成生物凝胶。因为多个纤维 蛋白原结合部分被固定于各个载体，且因为各个纤维蛋白原分子能够 结合至少两个纤维蛋白原结合部分，所述纤维蛋白原分子经由所述载 体而连接在一起。在所述纤维蛋白原分子和所述纤维蛋白原结合部分 之间形成非共价键。 因此，根据本发明，还提供形成生物凝胶的方法，其包括使纤维 蛋白原分子与多个载体接触，其中各个载体具有多个纤维蛋白原结合 部分，和各个纤维蛋白原分子能够结合至少两个纤维蛋白原结合部分， 从而所述纤维蛋白原分子通过在所述纤维蛋白原结合部分和所述纤维 蛋白原分子之间形成的非共价键，经由载体连接在一起。 根据本发明，还提供包含纤维蛋白原分子和多个载体的生物凝胶， 其中各个载体具有固定于该载体的多个纤维蛋白原结合部分，和各个 纤维蛋白原分子结合至少两个纤维蛋白原结合部分，从而所述纤维蛋 白原分子通过在所述纤维蛋白原结合部分和所述纤维蛋白原分子之间 形成的非共价键，经由载体连接在一起。 除了纤维蛋白原结合部分，该载体可以具有固定于各个载体的多 个纤维蛋白原结合前体，其中各个纤维蛋白原结合前体能够被转化为 纤维蛋白原结合部分。为了使用这样的载体形成生物凝胶，需要将纤 维蛋白原结合前体转化成纤维蛋白原结合部分，从而该纤维蛋白原结 合部分而后能够结合至纤维蛋白原分子。 因此，根据本发明还提供生物凝胶试剂盒(即，用于形成生物凝 胶的试剂盒)，其包含：多个载体、固定于各个载体上的多个纤维蛋 白原结合前体，其中各个纤维蛋白原结合前体可以被转化为纤维蛋白 原结合部分；和纤维蛋白原，其中各个纤维蛋白原分子能够结合至少 两个纤维蛋白原结合部分。 根据本发明还提供形成生物凝胶的方法，其包括：提供多个载体， 各个载体包含固定于该载体的多个纤维蛋白原结合前体；将所述纤维 蛋白原结合前体转化为纤维蛋白原结合部分；和将纤维蛋白原分子与 所述纤维蛋白原结合部分接触，其中各个纤维蛋白原分子能够结合至 少两个纤维蛋白原结合部分，从而所述纤维蛋白原分子通过在所述纤 维蛋白原结合部分和所述纤维蛋白原分子之间形成的非共价键，经由 载体连接在一起。 本发明的生物凝胶不需要能够粘着于组织基底。然而，本发明的 生物凝胶优选是组织粘合剂。本文使用的术语“组织粘合剂”意指能 够粘附于组织基片底(例如皮肤，或粘膜表面)的物质。可以将本发 明的生物凝胶或组织粘合剂用于止血、作为封闭剂、用于组织工程(例 如用作支持物)，或用于定位药物递送。 所述载体可以是可溶或不溶载体，但不是血小板。所述载体应该 适合局部施用于受试者的组织位点，例如，出血伤口位置，或者粘膜 位置。相对局部施用而言，可溶性载体可能更适于静脉内施用。所述 载体可以包含可溶或不溶蛋白质、治疗药物、多聚体(例如生物相容 的多聚体，例如聚乙二醇)、或这些的任意组合。 蛋白载体的实例是酶或非酶的蛋白质，例如人血清白蛋白。 可溶性载体可以是微粒(包括固体、中空或多孔的微粒优选基本 球状的微粒)。该微粒可以由任意合适的物质形成，例如交联蛋白。 合适的蛋白质是白蛋白(源自血清的或重组的，人或非人序列的)。 可以通过使用众所周知的喷雾干燥技术，例如在WO 92/18164中所述， 通过喷雾干燥人血清白蛋白形成在本发明中适合用作不溶载体的微 粒。 用作载体的微粒的备选包括脂质体、合成的聚合体颗粒(例如聚 乳酸、聚乙醇酸和多聚(乳酸/乙醇酸)、或细胞膜碎片。 本文使用的术语“纤维蛋白原”包括天然纤维蛋白原、重组纤维 蛋白原，或能够通过凝血酶转化形成纤维蛋白的纤维蛋白原的衍生物 (例如，天然或重组的纤维蛋白单体，或可以或不能自发组装的纤维 蛋白单体的衍生物)。该纤维蛋白原应该能够结合至少两个纤维蛋白 原结合部分。可以从任何来源，和从任何物种(包括牛纤维蛋白原) 获得该纤维蛋白原，但优选人纤维蛋白原。可以从自体血液或捐献血 液中获得人纤维蛋白原。优选自身的纤维蛋白原，因为在将本发明的 生物凝胶(或粘合剂)施用于受试者时，这降低了感染的风险。 优选的，该纤维蛋白原结合部分与纤维蛋白原结合的解离常数 (KD)在10-9至10-6M之间，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400nM 或更多。优选KD约为100nM。可以在平衡状态测量解离常数。例如， 可以将已知浓度的放射性标记的纤维蛋白原和已经交联有纤维蛋白原 结合部分的微球体孵育。通常，5μM肽与1mg微球体交联，或15-40 微摩尔肽与1mg微球体交联。将肽-连接的微球体稀释至0.5mg/ml， 和在pH 7.4的等渗缓冲液(例如，含有0.15M NaCl的0.01M Hepes 缓冲液)中，与浓度为0.05-0.5mg/ml的放射性标记的纤维蛋白原在 20℃孵育长达1小时。可以通过离心从游离的纤维蛋白原中将结合在 微球体上纤维蛋白原结合部分的纤维蛋白原分离，并测量游离和结合 的纤维蛋白原的量。然后通过绘制结合的纤维蛋白原浓度与结合：游 离纤维蛋白原浓度的比的关系曲线，通过Scatchard分析计算解离常 数，其中曲线的斜率代表KD。 在本发明的一些实施方案中，纤维蛋白原结合部分优选选择性地 结合纤维蛋白原。在其它实施方案中，优选纤维蛋白原结合部分能够 结合纤维蛋白原，和单独结合纤维蛋白单体和/或纤维蛋白。优选与纤 维蛋白原和纤维蛋白单体和/或纤维蛋白的结合是选择性的。 纤维蛋白原结合部分优选是纤维蛋白原结合肽或肽类似物。可以 使用任何合适的纤维蛋白原结合肽。例如，该肽可能能够结合于天然 结合纤维蛋白或通过血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa结合纤维蛋白的纤 维蛋白原的区域。在Mosesson等人，2001，Ann.N.Y.Acad.Sci.， 936，11-30中讨论结合于纤维蛋白原的纤维蛋白。在Bennett，2001， Annals of NY Acad.ScL，936，340-354中讨论GPIIb-IIIa与纤维 蛋白原的结合。 该肽可能能够结合于纤维蛋白原α链的羧基和/或氨基末端结构 域。具体而言，该肽可能能够结合在一个或两个这些结构域中含有RGD 的基序(例如，在氨基酸95-98的RGDF(SEQ ID NO：1)，或在氨基 酸572-575的RGDS(SEQ ID NO：2))。该肽可能能够结合于纤维蛋 白原γ链的羧基末端结构域，优选结合于此结构域的最后12个氨基酸 (序列HHLGGAKQAGDV(SEQ ID NO：3))。该肽可能能够结合于纤维 蛋白原γ链的D-结构域，例如D-结构域的β链区段。 纤维蛋白结合肽可以包含衍生自GPIIb或GPIIIa的纤维蛋白原- 结合区的序列。例如，该肽可能包含对应于GPIIb的294-314氨基酸 残基序列的序列AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM(SEQ ID NO：4)，或者其 保留了纤维蛋白原结合活性的片段或衍生物。已知保留纤维蛋白原结 合活性的片段是TDVNGDGRHDL(296-306)(SEQ ID NO：5)、 GDGRHDLLVGAPL(300-312)(SEQ ID NO：6)和GAPL(SEQ ID NO：7)。 TDVNGDGRHDL的合适的衍生物包括：T(D，E)VNG(D，E)GRH(D，E)L(SEQ ID NO：8)；TD(V，L)NGDGRHDL(SEQ ID NO：9)；TDV(N，Q)GDGRHDL (SEQ ID NO：10)；TDVNGDG(R，K)HDL(SEQ ID NO：11)。 纤维蛋白原结合肽可以包含GPIIIa的残基95-223序列，或其保 留了纤维蛋白原结合活性的片段或衍生物。例如，包含序列 SVSRNRDAPEGG(SEQ ID NO：12)的残基211-222被认为是GPIIIa中 重要的纤维蛋白原结合结构域。GPIIIa的其它合适的区域包括残基 109-171和164-202。 纤维蛋白原结合肽可以包含通过凝血酶作用而暴露于纤维蛋白原 上的残基的序列，和其结合纤维蛋白原作为产生纤维蛋白的聚合反应 中的第一步。凝血酶从纤维蛋白原的α和β链的N末端切割肽(释放 纤维蛋白肽a和b)从而分别暴露序列NH2-GPR-(SEQ ID NO：13)和 NH2-GHR-(SEQ ID NO：14)。因此，纤维蛋白原结合肽的优选实例包 含在其氨基末端的氨基酸序列NH2-G(P，H)RX-(SEQ ID NO：15)，其 中X是任意的氨基酸，和(P，H)意指在该位置是脯氨酸或组氨酸。该 肽优选在其氨基末端包含序列NH2-GPRP-(SEQ ID NO：16)。 该纤维蛋白原结合肽长度优选是4-30，更优选4-10个氨基酸残 基。 纤维蛋白原结合前体不应该结合纤维蛋白原，因此当所述载体与 纤维蛋白原接触时，纤维蛋白原分子经由带有固定的纤维蛋白原结合 前体的载体被连接在一起。优选纤维蛋白原结合前体对纤维蛋白原的 解离常数大于1×106M。所述纤维蛋白原结合前体可以是肽或肽类似物， 但是优选是肽。纤维蛋白原结合前体不应该是纤维蛋白原或不应该包 含纤维蛋白原。 在本发明优选的实施方案中，纤维蛋白原结合前体包含在其氨基 末端结合于阻断元件(优选肽)的纤维蛋白原结合肽，所述阻断元件 阻断或抑制(即，减少)纤维蛋白原结合于纤维蛋白原结合肽。通过 转化剂(优选凝血因子，例如凝血酶)对纤维蛋白原前体的切割，暴 露结合于载体的纤维蛋白原结合肽，从而将所述纤维蛋白原结合前体 转化为纤维蛋白原结合部分。在这样的实施方案中，该阻断元件阻断 或抑制纤维蛋白原结合肽结合纤维蛋白原的能力，直至切割发生。优 选该阻断元件是长度为1-30个氨基酸的肽。 应该了解在这样的实施方案中，所述纤维蛋白原结合前体应该包 含能够被转化剂特异性识别的切割位点，且其位于所述纤维蛋白原结 合肽和阻断元件之间。凝血酶是优选的转化剂。然而，可以使用其它 的丝氨酸蛋白酶或凝血因子来切割纤维蛋白原结合前体。已知凝血酶 切割精氨酸残基羧基末端的肽键，且通常在精氨酸和甘氨酸残基之间 切割。 在本发明的特别优选的实施方案中，纤维蛋白原结合前体是在其 氨基末端包含了氨基酸序列NH2-ZYXR/GPRP-(SEQ ID NO：17)的肽， 其中“/”代表凝血酶切割位点，和X是任意的氨基酸，但是优选脯氨 酸，Y是任意的氨基酸，但是优选天冬氨酸或丙氨酸，和Z是至少一 个氨基酸，其优选为亮氨酸或脯氨酸。例子为：NH2-LVPR/GPRP-(SEQ ID NO：18)、NH2-ADPR/GPRP-(SEQ ID NO：19)、NH2-LDPR/GPRP-(SEQ ID NO：20)、或NH2-LVPR/GPRV-(SEQ ID NO：21)。 纤维蛋白原结合部分或前体可以通过任何适当的手段，但一般通 过共价键结合于载体。优选的共价键的例子是二硫键、硫醚键或酰胺 键。当纤维蛋白原结合部分或前体是包含半胱氨酸的肽且载体包含巯 基反应基团时，可以形成合适的共价键。这使该肽能够通过半胱氨酸 的-SH基团与载体上的巯基反应基团连接而结合于载体。优选将末端 半胱氨酸基团掺入纤维蛋白原结合肽或前体肽，从而使该肽与载体上 的巯基反应基团相交联。或者，当纤维蛋白原部分或前体是包含顺丁 烯二酰亚胺基(优选在其羧末端，例如，连接于该肽的羧基末端赖氨 酸)的肽，且载体包含巯基的时候，可以形成共价键。而后，可以通 过使该肽的顺丁烯二酰亚胺基与载体的巯基反应，使该肽结合于载体。 通常，在纤维蛋白原结合部分或前体和载体之间需要间隔子以确 保该纤维蛋白原结合部分的纤维蛋白原结合活性(如果一旦从纤维蛋 白原结合前体转化需要)没有受到载体的不利影响。合适的间隔子是 肽，或非肽，例如聚乙二醇。 其中纤维蛋白原结合部分或前体是包含纤维蛋白原结合肽的肽， 且该部分或前体通过末端氨基酸残基结合于不溶载体，间隔序列优选 在末端氨基酸残基和纤维蛋白原结合肽的部分或前体之间存在。该间 隔子长度可以是，例如，1-20，优选5-20个氨基酸残基。优选GGGGGG (SEQ ID NO：22)或GGGGG(SEQ ID NO：23)的间隔子序列。 应该理解，对于最佳生物凝胶(或组织粘合剂)形成所需的每个 载体的纤维蛋白原结合部分或前体的数目，和载体(每个载体具有多 个纤维蛋白原结合部分或前体)和纤维蛋白原的相对量，可以随着载 体和纤维蛋白原的不同制备而改变。因此，可能需要或期望测试各新 批次的载体或纤维蛋白原以确定用于生物凝胶形成的载体和纤维蛋白 原的最佳相对量。 优选每个载体各具有平均至少5个纤维蛋白原结合部分或前体。 理论上，每个载体的纤维蛋白原结合部分或前体的数目没有上限。最 佳数目可能决定于许多因素，例如载体的特性，和在各个载体上用于 连接纤维蛋白原结合部分或前体的反应基团数目。然而，优选每个载 体各自具有平均在100个以上的纤维蛋白原结合部分或前体。优选的 范围是每个载体的纤维蛋白原结合部分或前体为10-20个。 优选地，与纤维蛋白原结合部分或前体的摩尔数相比，使用的纤 维蛋白原的量是存在的纤维蛋白原摩尔数的至少四分之一(优选至少 一半)。优选的，纤维蛋白原的摩尔数相对于纤维蛋白原结合部分或 前体的摩尔数是在1∶4至4∶1范围。 可以使用动力学振动测量来评估根据本发明形成的生物凝胶的粘 弹性特征。在粘弹性固体中储能模量(G′)和损耗模量(G″)测量代表弹 性部分贮存的能量，和代表粘性部分的作为热消散的能量。Tan delta 是损耗模量(G″)与储能模量(G′)的比率。因此它是弹性和粘性贡献的 量化，其中数值大于1表示液体状的粘性行为，而数值小于1表示弹 性行为。优选本发明的生物凝胶具有小于1的tan delta。这表明凝 胶的组分被交联。可以在1Hz频率和1％的恒应变(constant strain) 确定tan delta。测量tan delta的合适方法在以下实施例中有更具 体的描述。 可以彼此分开的贮存本发明试剂盒的组份，或者如果这些组份贮 存在一起不会相互反应，也可以将试剂盒的一些或全部组份贮存在一 起。对于本发明的实施方案，其中该试剂盒包含带有固定的纤维蛋白 原结合部分的载体，应该理解纤维蛋白原应该与所述载体分开贮存， 以使它不与所述载体反应。本发明的试剂盒包含了纤维蛋白原和带有 固定的纤维蛋白原结合前体的载体，该前体不结合纤维蛋白原，该试 剂盒的重要优势在于，所述载体和所述纤维蛋白原能够一起贮存。 本发明的试剂盒的组份可以在用于将该成份递送至组织或其它位 点的装置(例如，注射器)内彼此分开贮存。可以设置该装置从而使 所述组份在递送至组织或其它位点时彼此接触。 本发明的试剂盒可以包括关于如何使用试剂盒的组份来产生生物 凝胶或组织粘合剂的说明书。 本发明的试剂盒具有这样的好处：不需要毒性剂，可以简单使用 试剂盒的组份产生生物凝胶(或组织粘合剂)，和可以容易的在稳定 条件贮存组份。还应该理解，使用本发明的试剂盒在生物凝胶或组织 粘合剂的形成中不需要存在凝血酶(或其它酶)。特别有利的是本发 明的试剂盒不包括凝血酶，因为相对于使用外源凝血酶形成的生物凝 胶或组织粘合剂，使用这样的试剂盒产生的生物凝胶或组织粘合剂产 生过敏反应的风险被降低了。不包括凝血酶(或其它酶)的本发明试 剂盒的另一优点在于不需要在保持酶活性的条件贮存该试剂盒的组 份。 根据本发明的一些实施方案，可以通过转化剂将纤维蛋白原结合 前体转化成纤维蛋白原结合部分，所述转化剂存在于施用了具有固定 的纤维蛋白原结合前体的载体的位点。这样的好处在于不需要将转化 剂作为该试剂盒的部分。因此，不需要在保持转化剂活性的条件下贮 存该试剂盒的组份。 优选该转化剂是伤口位点剂。本文中使用术语“伤口位点剂”意 指在伤口位点存在的制剂。在优选的实施方案中，该伤口位点剂是凝 血因子。合适的凝血因子的例子包括凝血酶、因子VIIa、因子Xa或 因子XIa。优选该凝结因子是凝血酶。 根据其它的实施方案，本发明的试剂盒还可以包含转化剂，其将 纤维蛋白原结合前体转化为纤维蛋白原结合部分。该转化剂应该与载 体分开。在这样的实施方案中，该转化剂可以是不预期存在于待施用 载体的位点的制剂。或者该转化剂可以是存在于施用了载体的位点的 制剂。该转化剂可以是凝血因子，例如凝血酶、因子VIIa、因子Xa、 或因子XIa。 包含具有固定的纤维蛋白原结合部分载体的本发明的试剂盒还可 以包含凝血因子。本发明的试剂盒包含纤维蛋白原结合前体，所述前 体可以通过凝血因子被转化为纤维蛋白原结合部分，所述试剂盒可以 包含凝血因子，该因子不会将所述纤维蛋白原结合前体转化为纤维蛋 白原结合部分。在这样的实施方案中，可以提供凝血因子(其不转化 纤维蛋白原结合前体)作为试剂盒的独立成份，或与载体和/或纤维蛋 白原一起提供。凝结因子可以被固定于载体，例如偶联于各纤维蛋白 原结合前体。 当本发明的试剂盒包含凝结因子(例如凝血酶)时，优选人序列 的凝结因子，而不是非人的凝结因子(例如牛凝结因子)，以减少对 凝结因子的过敏反应风险。 可以在施用于组织位点之前形成，或者在组织位点，例如在伤口 位点，原位形成本发明的生物凝胶或组织粘合剂。在组织位点的生物 凝胶或组织粘合剂优选包含局部施用的载体。 应该理解可以在施用或形成本发明的生物凝胶或组织粘合剂的组 织位点存在凝血酶。例如，如果该组织位点是出血伤口位点，宿主凝 血酶可能存在于伤口位点。当然，如果本发明的试剂盒提供，可以备 选或另外存在凝血酶。 如果在凝血酶存在下形成本发明的生物凝胶或粘合剂，或一旦形 成本发明的生物凝胶或粘合剂后与凝血酶接触，则使用能够结合纤维 蛋白原和独立结合纤维蛋白单体和/或纤维蛋白的纤维蛋白结合部分 是有利的。如果凝血酶与纤维蛋白原和具有固定的纤维蛋白原结合部 分的载体一起存在，则该凝血酶将至少部分纤维蛋白原转化为纤维蛋 白单体。应该理解，在这些条件下，优选纤维蛋白原结合部分也结合 纤维蛋白单体，从而可以通过载体将由凝血酶形成的纤维蛋白单体连 接起来。 如果一旦形成本发明的生物凝胶或粘合剂即与凝血酶接触，那么 如果结合于纤维蛋白原结合部分的纤维蛋白原能够被转化为纤维蛋白 单体且该纤维蛋白原结合部分保持结合于纤维蛋白单体是有利的。在 这样的情况下，在纤维蛋白原和纤维蛋白原结合部分之间形成的非共 价键将不会由于纤维蛋白原转化成纤维蛋白单体而断裂。如果结合于 纤维蛋白原结合部分的至少一些的纤维蛋白原能够组装形成纤维蛋白 同时保持结合于纤维蛋白原结合部分，也是有利的。在这些情况下， 可以通过形成纤维蛋白而强化生物凝胶或组织粘合剂。 如果存在凝血酶(例如，来自本发明的试剂盒，或伤口位点的宿 主凝血酶)，优选在接触凝血酶之前使载体和纤维蛋白原彼此接触， 或使载体、纤维蛋白原和凝血酶在基本相同的时间彼此接触。 如果在与载体接触之前凝血酶和纤维蛋白原彼此接触，尽管可能 形成生物凝胶或组织粘合剂，可能预期其作用小于在接触凝血酶之前 将载体和纤维蛋白原彼此接触，或将载体、纤维蛋白原和凝血酶在基 本相同的时间彼此接触。这是因为凝血酶预期将纤维蛋白原分子转化 为纤维蛋白单体，该单体在与载体接触之前凝结形成不溶的纤维蛋白。 然而，在一些情况下，例如，如果凝血酶直到接触载体或之后是无活 性的，通过先于载体将凝血酶和纤维蛋白原彼此接触而形成生物凝胶 或组织粘合剂可能是恰当的。 根据本发明还提供形成生物凝胶的方法，其包括将多个载体与纤 维蛋白原分子和凝血酶接触(其中多个纤维蛋白原结合部分被固定于 各载体)，且各纤维蛋白原分子能够结合至少两个纤维蛋白原结合部 分，从而形成生物凝胶，其中纤维蛋白单体通过在纤维蛋白原结合部 分和纤维蛋白单体之间的非共价键，经由载体被连接在一起。 生物凝胶可以包含或不包含纤维蛋白。因此，纤维蛋白可以是生 物凝胶中的纤维蛋白部分，或纤维蛋白单体可以不是生物凝胶中的纤 维蛋白部分。 根据本发明还提供生物凝胶，其包含纤维蛋白单体和多个载体， 各载体具有多个固定于所述载体的纤维蛋白原结合部分，其中通过在 纤维蛋白原结合部分和纤维蛋白单体之间的非共价键，经由所述载体 将所述纤维蛋白单体连接在一起。 根据本发明还提供生物凝胶，其包含纤维蛋白和多个载体，各载 体具有多个固定于所述载体的纤维蛋白原结合部分，其中通过在纤维 蛋白原结合部分和纤维蛋白单体之间的非共价键，经由所述载体将所 述纤维蛋白的纤维蛋白单体连接在一起。 在优选的方面，所述生物凝胶是组织粘合剂。 本发明的试剂盒可以包含因子XIII，和任选的钙离子和凝血酶以 激活因子XIII成为因子XIIIa(如果这样，钙离子和凝血酶应该与因 子XIII分隔开)。备选的或另外的，可能在施用或形成本发明的生物 凝胶或组织粘合剂的组织位点存在因子XIIIa。例如，如果该组织位 点是出血伤口位点，可能在伤口位点存在宿主因子XIIIa。 如果使因子XIIIa与包含纤维蛋白的本发明的生物凝胶或组织粘 合剂接触，可以进一步通过因子XIIIa与纤维蛋白的反应来共价交联 纤维蛋白而强化该生物凝胶或组织粘合剂。 根据本发明还提供形成生物凝胶的方法，其包括：将多个载体与 纤维蛋白原分子和凝血酶接触，其中多个纤维蛋白原结合部分被固定 于各载体，且各个纤维蛋白原分子可以结合至少两个纤维蛋白原结合 部分，形成包含纤维蛋白的生物凝胶，其中所述纤维蛋白的纤维蛋白 单体通过在所述纤维蛋白原结合部分和所述纤维蛋白单体之间的非共 价键，经由所述载体被连接在一起；和将生物凝胶与因子XIIIa接触， 从而所述纤维蛋白的纤维蛋白单体可以通过肽键被共价连接在一起。 根据本发明还提供生物凝胶，其包含纤维蛋白和多个载体，各载 体具有固定于载体的多个纤维蛋白原结合部分，其中所述纤维蛋白的 纤维蛋白单体通过肽键被共价连接在一起，且所述纤维蛋白的纤维蛋 白单体通过在所述纤维蛋白原结合部分和所述纤维蛋白单体之间的非 共价键，经由所述载体被连接在一起。 在优选的方面，该生物凝胶是组织粘合剂。 本发明的试剂盒还可以包含伤口愈合的促进剂。合适的实例包括 生长因子，例如血小板衍生的生长因子。该促进剂可以是试剂盒的单 独的组份，或固定于所述载体。 本发明的试剂盒还可以包含抗微生物剂，例如抗生素。所述抗微 生物剂可以是试剂盒的独立的组份，或固定于所述载体。 应该理解，如果将具有多个固定于各载体的纤维蛋白原结合部分 的载体施用于其中存在宿主纤维蛋白原的组织位点(例如，在出血伤 口位点)，该载体将与宿主的纤维蛋白原反应，在组织位点原位形成 生物凝胶或组织粘合剂。 相似的，如果将具有多个固定于各载体的纤维蛋白原结合前体的 载体施用于其中存在转化剂和宿主纤维蛋白原的组织位点(例如出血 伤口位点)，该转化剂将纤维蛋白原结合前体转化为纤维蛋白原结合 部分，所述纤维蛋白原结合前体将被转化为纤维蛋白原结合部分，且 该载体而后将与宿主纤维蛋白原反应，在组织位点原位形成生物凝胶 或组织粘合剂。例如，可以通过宿主凝血酶或另一凝血因子将纤维蛋 白原结合前体转化为纤维蛋白原结合部分。 因此，根据本发明还提供包含局部施用的载体和内源性纤维蛋白 原的生物凝胶，各载体具有多个固定于所述载体的纤维蛋白原结合部 分，其中内源性纤维蛋白原的各分子结合至少两个纤维蛋白原结合部 分，从而纤维蛋白原分子通过在所述纤维蛋白原结合部分和所述内源 性纤维蛋白原分子之间的非共价键，经由所述载体被连接在一起。 本文使用的术语“内源性纤维蛋白原”意指该纤维蛋白原是宿主 纤维蛋白原，其在施用载体的位点存在。通常，存在宿主纤维蛋白原 是因为在伤口位点存在宿主的血液。 根据本发明还提供载体用于形成生物凝胶的用途，该载体具有固 定于所述载体的多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前体。 生物凝胶优选是组织粘合剂。 可以使用载体形成生物凝胶或组织粘合剂用于止血、作为封闭剂、 用于定位的药物递送、或用于组织工程。 因为不需要外源性纤维蛋白原或凝血酶，不需要毒性剂，且所述 载体可以容易的在稳定条件下贮存，使用载体形成生物凝胶或组织粘 合剂具有宿主过敏反应最小化的优点。 根据本发明还提供在存在宿主纤维蛋白原的位点控制出血的方 法，其包括向该位点局部施用多个载体，其中各载体具有固定于所述 载体的多个纤维蛋白原结合部分，和在该位点的宿主纤维蛋白原分子 能够结合至少两个纤维蛋白原结合部分。 根据本发明还提供在存在宿主纤维蛋白原和凝结因子的位点控制 出血的方法，其包括向该位点局部施用多个载体，其中各载体具有固 定于所述载体的多个纤维蛋白原结合前体，且能够通过宿主凝血因子 将该纤维蛋白原结合前体转化为纤维蛋白原结合部分，且在该位点的 宿主纤维蛋白原分子能够结合至少两个所述纤维蛋白原结合部分。 根据本发明还提供多个载体在制备用于控制出血或治疗或封闭伤 口的药物(例如生物凝胶或组织粘合剂)中的用途，其中各载体具有 固定于所述载体的多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前体。 根据本发明还提供多个载体在形成生物凝胶中的用途，所述各载 体具有固定于该载体的多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前 体。 根据本发明还提供用于(例如，作为生物凝胶或组织粘合剂)控 制出血或治疗或封闭伤口的多个载体，其中各载体具有固定于载体的 多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前体。 载体可以是不溶或可溶的。可以将载体局部施用。 如果载体是可溶载体，具有固定于该载体的多个纤维蛋白原结合 部分或纤维蛋白原结合前体的载体的优选局部制剂是液体制剂，优选 生理pH的等渗制剂。 如果载体是不溶载体，具有固定的多个纤维蛋白原结合部分或纤 维蛋白原结合前体的载体的优选局部制剂是能够被喷雾，例如施于组 织位点上的粉末的形式。 可以使用任何合适的方法形成粉末化的载体，包括包含喷雾干燥 的方法或冷冻干燥载体的悬浮液，所述载体具有固定于各载体(例如 在生理pH等渗缓冲液中悬浮的载体)的多个纤维蛋白原结合部分或纤 维蛋白原结合前体。优选使用喷雾干燥，因为这是比冷冻干燥更快速 和容易标定的干燥方法。合适的喷雾干燥方法描述于WO 92/18164。 根据本发明还提供用于形成生物凝胶的制剂，该制剂包含可溶性 载体，其中多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前体固定于各 载体。 根据本发明还提供用于形成生物凝胶的制剂，该制剂包含不溶载 体，所述载体具有固定于各载体的多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋 白原结合前体，其中该物质是通过非冷冻干燥而形成的粉末形式。 根据本发明还提供形成粉末制剂的方法，该制剂包含具有固定于 各载体的多个纤维蛋白原结合部分或纤维蛋白原结合前体的不溶载 体，其中该方法包含对所述制剂的悬浮液的喷雾干燥。 优选的，该制剂适合局部施用。如果该制剂包含具有固定于各载 体的多个纤维蛋白原结合前体的可溶载体，则该制剂可适合于静脉施 用。 可以将所述载体或制剂作为试剂盒的组份提供。该试剂盒还可以 包含凝血因子、伤口愈合的促进剂、或抗微生物剂。该凝血因子、伤 口愈合的促进剂、或抗微生物剂可以是独立的试剂盒的组份，或固定 于载体。在一些优选的实施方案中，所述凝血因子、伤口愈合的促进 剂、或抗微生物剂可以是纤维蛋白原结合前体的部分，从而当纤维蛋 白原结合前体被转化为纤维蛋白原结合部分时其被释放。 本发明的试剂盒可以是间隔化的试剂盒，其中该试剂盒的组份需 要彼此分开的保存，被保存在分开的间隔或容器内。本发明的试剂盒 可包括使用试剂盒组份来执行本发明方法的说明书。 可以将本发明的生物凝胶或组织粘合剂局部施用于组织位点，例 如皮肤或粘膜组织。可以将本发明的生物凝胶或组织粘合剂用于止血、 作为封闭剂、用于定位的药物递送或用于组织工程。 可以通过在将凝胶或粘合剂与施用位点接触之前形成凝胶或粘合 剂，或通过在施用位点形成生物凝胶或组织粘合剂来施用本发明的生 物凝胶或组织粘合剂。 也应该理解，可以以静脉注射施用包含可溶载体的制剂，例如用 于控制出血或用于药物递送，其中各能够被转化为纤维蛋白原结合部 分的多个纤维蛋白原结合前体被固定于各载体。优选的静脉注射制剂 是20％的等渗水溶液。在优选的实施方案中，可以通过凝血酶来转化 纤维蛋白原结合前体。 根据本发明还提供控制出血的方法，其包括静脉内的施用包含可 溶载体的制剂，其中各能够被转化为纤维蛋白原结合部分的多个纤维 蛋白原结合前体被固定于各载体。 根据本发明还提供向受试者递送药物的方法，其包括向受试者静 脉内的施用包含可溶载体的制剂，其中各能够被转化为纤维蛋白原结 合部分的多个纤维蛋白原结合前体被固定于各载体，且其中所述载体 包含药物或药物被固定于该载体。 当然局部或静脉注射制剂应该是无菌的。 本发明的生物凝胶和组织粘合剂还可以包含伤口愈合促进剂，或 抗微生物剂。 根据本发明还提供控制出血的方法，其包括向出血位点局部施用 本发明的生物凝胶或组织粘合剂。 根据本发明还提供治疗或封闭伤口的方法，其包括向伤口位点施 用(优选局部地)本发明的生物凝胶或组织粘合剂。 根据本发明还提供本发明的生物凝胶或组织粘合剂作为药物。 根据本发明还提供本发明的生物凝胶或组织粘合剂在制备用于控 制出血或用于治疗或封闭伤口中的药物中的用途。 根据本发明还提供本发明的生物凝胶或组织粘合剂，其用于控制 出血或治疗或封闭伤口。 本发明的生物凝胶或组织粘合剂可以被局部的使用。如果该生物 凝胶或组织粘合剂与可溶载体和从纤维蛋白原结合前体转化而来的纤 维蛋白原结合部分一起形成，该用途可以是静脉内的。 实施例 现在仅通过实施例来描述本发明的优选的实施方案。 根据本发明优选的实施方案，多个肽在其羧基末端被连接于载体， 所述各肽在其氨基末端包含纤维蛋白原结合序列(例如序列 GPRPGGGGGGC(SEQ ID NO：24)的肽)，其为可溶蛋白质(例如白蛋 白)。通过将肽连接的载体与纤维蛋白原接触形成生物凝胶。而后可 以将该生物凝胶局部施用于伤口作为包扎。 根据本发明的第二优选的实施方案，将第一优选的实施方案的肽 连接的载体与纤维蛋白原在伤口位点混合从而原位形成生物凝胶。 根据本发明的第三优选的实施方案，将第一优选的实施方案的肽 连接的载体施用于伤口位点以原位形成生物凝胶，在所述位点存在来 自宿主血液的纤维蛋白原。 根据本发明的第四优选的实施方案，多个肽于其羧基末端被连接 于载体，所述各肽包含在其氨基末端偶联于封闭肽序列(例如，序列 LVPRGPRPGGGGGGC(SEQ ID NO：25)的肽)的纤维蛋白原结合序列， 该载体是可溶蛋白质(例如白蛋白)。可以将该肽连接的载体与纤维 蛋白原组合，而后作为单个混合物应用于伤口。在伤口位点存在的宿 主凝血酶切割该肽，释放封闭肽，并暴露纤维蛋白原结合序列。具有 暴露的纤维蛋白原结合序列的载体与纤维蛋白原反应，原位形成生物 凝胶。 备选的，可以静脉内的施用第四优选的实施方案的肽连接的载体。 在伤口位点的宿主凝血酶切割该肽释放封闭肽并暴露纤维蛋白原结合 序列。具有暴露的纤维蛋白原结合序列的载体与宿主纤维蛋白原反应 以控制伤口位点的出血。 上述第四优选的实施方案的生物凝胶可以是组织粘合剂。 在任意以上优选的实施方案中(除了静脉内施用)，可以使用不 溶载体(例如白蛋白微球体)代替可溶蛋白载体。 在任意以上优选的实施方案中，可以使用分支的聚乙二醇(PEG) 或任何其它的生物可溶性的聚合物代替可溶的蛋白质载体。 如果其中纤维蛋白原是被固定于载体上，在任意以上优选的实施 方案中，可以将凝血因子固定于载体上，所述凝血因子不会将纤维蛋 白原结合前体转化为纤维蛋白原结合部分。 在任意以上优选的实施方案中，所述载体还可以包含伤口愈合的 促进剂(例如，生长因子，如血小板衍生的生长因子)。 附图说明 在下列实施例中参考附图对本发明的优选的实施方案做进一步描 述，其中： 图1以示意图表明：(a)具有固定于该载体的多个纤维蛋白原结 合肽的白蛋白载体；(b)纤维蛋白原分子；和(c)生物凝胶，其中 通过在所述纤维蛋白原结合肽和纤维蛋白原分子之间的非共价键，经 由所述载体将所述纤维蛋白原分子连接在一起； 图2显示在20℃(A)和37℃(B)的在25μl的肽修饰的HSA 和32mg/ml纤维蛋白原的混合物中，储能模量(正方形)和损耗模量 (三角形)与应变百分数的关系曲线图； 图3显示在20℃(具有1％应变波幅(stain amplitude))的对 于25μl的肽修饰的HSA与32mg/ml纤维蛋白原的混合物中，储能模 量(正方形)和复数粘度(三角形)与频率的关系曲线图；和 图4显示在加入肽修饰的HSA之前(a)和之后(b)纤维蛋白原 溶液的显像。 实施例1：使用纤维蛋白原形成生物凝胶或组织粘合剂，和固定 于载体的纤维蛋白原结合肽包含人血清白蛋白。 将人血清白蛋白(HSA)与40倍摩尔过量的接头琥珀酰亚氨基-4- (N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)在pH 7.4反应。对 修饰的蛋白质(HAS-SMCC)进行纯化，并测定出平均一摩尔的HAS被 18摩尔SMCC修饰。将GPRPGGGGGGC(B10；SEQ ID NO：24)或 LVPRGPRPGGGGGGC(TC-15；SEQ ID NO：25)肽以相对于马来酰亚胺部 分超出1.5摩尔的量加入到HSA-SMCC。然后从未反应的肽纯化肽修饰 的HSA蛋白，并以7mg/ml贮存在-80℃。按照供应商所述，将冷冻干 燥的人纤维蛋白原以16mg/ml溶解于水中(苏格兰国家血液输送服务 中心)。 将肽修饰的HSA蛋白(5μl)加入0.3ml的纤维蛋白原溶液， 对于B10-HAS立即观察到凝胶而对于TC-15没有观察到凝胶。已知暴 露的GPRP肽序列结合于在纤维蛋白原的两个远端结构域(D)的羰基区 域内的口袋“a”(图1b)。认为用多个暴露的GPRP序列(B10)修 饰的HAS作为纤维蛋白原的聚合作用的分支点(图1c)。在缺乏凝血 酶的条件下形成该凝胶。 实施例2-5合成肽修饰的HSA的方法 将10mg/ml的人血清白蛋白(HSA)与5、10、20或40倍摩尔过 量的接头硫代琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧 化物(硫代-SMCC)在pH 7.4反应，总反应体积为0.7ml。通过ZebraTM 脱盐柱(Pierce，Rockford，IL)纯化x修饰的蛋白(HSA-SMCC)，并测 定出平均一摩尔的HSA分别经5、8、16或18摩尔的硫代-SMCC修饰。 为了测定每个HSA分子结合的马来酰亚胺基数，在缓冲液中，将3纳 摩尔的HSA与已知量的半胱氨酸(100纳摩尔)在室温温育30分钟。 然后将剩余的半胱氨酸与1毫摩尔的5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸盐) (DTNB)反应20分钟，并测量在A412的吸光度。通过比较对照和蛋白样 品的吸光度，计算马来酰亚胺水平。以相对于马来酰亚胺部分超过1.5 摩尔的量，将GPRPGGGGGGC(B10；SEQ ID NO：24)或LVPRGPRPGGGGGGC (TC-15；SEQ ID NO：25)肽加入到HSA-SMCC。然后使用Zebra脱盐 柱(Pierce，Rockford，IL)从未反应的肽纯化肽修饰的HSA蛋白，和以 7mg/ml贮存在-80℃。将冷冻干燥的人纤维蛋白原(苏格兰国家血液 输送服务中心，爱丁堡，苏格兰)以8、16、32和64mg/ml浓度溶解 于水中。使用1％纤维蛋白原E280＝15和1％HSA E280＝13.8的转化因子 通过在280nm(A280)的吸光度测定纤维蛋白原和白蛋白的浓度。 流变学特征 使用动力振荡测量来评估该凝胶的粘弹性。使该混合物在室温平 衡过夜，并将该凝胶转移至Physica MCR-501(Anton Paar，德国) 流速计的低平板上，该流速计具有25mm直径平板的锥体和1°的锥度。 在湿润的空气中以20或37±℃进行试验。在1％的恒应变波幅，在 0.01和50Hz之间进行频率扫描。用流速计提供的专用的Anton Paar 软件处理检查到的流变学参数。 实施例2肽修饰的HSA的量和纤维蛋白原浓度对凝胶形成的影响。 在混合纤维蛋白原和HSA溶液之后，先目测监控纤维蛋白原的聚 合作用。将用5、8、16或18摩尔的纤维蛋白原结合肽修饰的肽修饰 HSA缀合于一摩尔的HSA。将25μl的肽修饰的HSA样品或未修饰的 HSA与8、16、32或64mg/ml的0.2ml的纤维蛋白原混合。在室温0.5 小时之后，目测凝胶的形成。对于未修饰的HSA或用5或8摩尔的肽 修饰的HSA，在测试的全部纤维蛋白原浓度均未观察到凝胶形成。仅 在32或64mg/ml纤维蛋白原观察到聚合作用，所述纤维蛋白原带有 16或18摩尔结合肽的肽修饰的HSA。 图4显示在加入肽修饰的HSA(25μl，18摩尔肽)之前(a)和 之后(b)的纤维蛋白原溶液(0.2ml 32mg/ml纤维蛋白原)的显影。 根据本发明形成的生物凝胶在(b)中显示。 实施例3肽修饰的HSA量的影响 为测定肽修饰的HSA和纤维蛋白原的量对混合物的流变性质的影 响，用25或50μl的肽修饰的HSA与32和64mg/ml的纤维蛋白原进 行剪切强度测量。每摩尔HSA是用16摩尔的结合肽修饰，使用该肽修 饰的HSA用于本试验。为了确保该动力学振荡试验是在凝胶的线性粘 弹性应变极限内完成，进行应变扫描。图2显示对25μl的肽修饰的 HSA混合32mg/ml的纤维蛋白原在20℃和37℃的应变扫描。储能模量 (G′)和损耗模量(G″)都显示在所述范围内稳定，并在此线性粘弹性应 变范围内选择1％的恒应变。频率扫描证明G′值是大于G″，其为交联 网络的指标(表1)。在该表中显示的数值是在1Hz的频率记录的。 Tan delta是损耗模量对储能模量的比率。因此它是弹性和粘性贡献 的定量，其中数值大于1表示类似液体的粘性行为，而小于1表示弹 性行为。复数粘度η*，定义为复数模量G*除以角频率(ω)，在相 同条件下对其进行测定。在这些条件下显示肽修饰的HSA和纤维蛋白 原的量都不非常影响该凝胶的机械强度。 表1： 不同批次的肽修饰的HSA，每个HSA结合18个肽(25μl)和 32mg/ml纤维蛋白原，显示G′为5200，复数粘度为820和Tan delta 为0.105。 实施例4温度对流变性质的影响 当用于外科体温或局部应用时，温度对凝胶影响的检查对于该产 品的应用是重要的。我们在20和37℃评估该凝胶的机械强度，并在 表2给出在1Hz频率采集的数值。增加该凝胶的温度导致G和复数粘 度都下降(表2)，该凝胶是由32mg/ml的纤维蛋白原和用16摩尔的 肽修饰的25μl的HSA产生。在20℃和37℃，tan delta都小于1， 因此(非共价的)交联网络结构是维持在37℃。 表2： 温度(℃) 20 37 储能模量(G′) 432 109 复数粘度(η*) 88 21 Tan delta 0.22 0.72 实施例5在人血浆中的凝胶形成 研究肽修饰的HSA是否能够在人血浆中聚合纤维蛋白原，这对于该 产品作为外科胶/粘合剂的应用是重要的。将用18摩尔肽修饰的肽修饰 的HSA(75μl)与0.8ml的人混合血浆混合。关于血浆衍生凝胶的流变 学在37℃进行，和给出G′值为6100，tan delta为0.104。从此结果推 论，肽修饰的HSA能够在人血浆聚合纤维蛋白原，在37℃产生(非共价) 交联网络结构。