技术领域 本发明涉及生物领域中的一种编码基因及其检测方法，特别涉及一种与牙 本质发育不全II型相关的突变基因及其检测方法。 背景技术 牙本质发育不全症属于常染色体显性遗传病，群体中男性和女性发病概率均 等。其中，牙本质发育不全症II(dentinogenesis imperfecta type II，DGI-II) 外显率为100％，群体中发病率约为1/8000。牙本质发育不全II型的主要临床表 现为乳牙及恒牙均呈灰色至深棕色，且伴有乳白色光泽因而得名乳光牙。牙冠 呈球形，牙根变细，X射线结果显示髓腔及根管变窄或完全闭塞。患者牙釉质易 剥离，剥离后暴露出牙本质，使发育不良的牙本质过度磨损，造成牙齿显著变 短，甚至可达牙槽嵴水平，尤以中切牙、侧切牙、第一、二磨牙最为明显。 牙本质发育不全症的相关基因已被克隆，定位于4q2l的区域。牙本质形成 期间成牙本质细胞分泌的细胞外基质主要由I型胶原和非胶原蛋白组成。其中牙 本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein， DPP)为主要的非胶原蛋白，它们与胶原相互作用，在牙本质矿化过程中起关键 作用。DSP与DPP是DSPP基因编码的单一转录物的表达产物。DSPP由5个 外显子和4个内含子组成，外显子1～4编码DSP，外显子5编码DSP的羧基 端和整个DPP。DSP是一分子量为95KDa富含唾液酸的的酸性糖蛋白，由于其 在成牙本质细胞及前期成釉细胞中的特有表达，DSP被认为在牙本质形成过程 中起重要作用。DPP是一富含天门冬氨酸和磷酸丝氨酸的蛋白。当前期牙本质 向牙本质转化时，成牙本质细胞分泌DPP到矿化前沿，DPP可能参与了牙本质 基质胶原的初期矿化。大量研究表明，DSPP是牙本质发育不全II型的致病基因， 可是其致病基因的突变点位却不尽相同，目前已在多个家系中发现了不同的突 变位点。因此，了解DSPP的各种致病位点，对于深入认识牙本质发育不全II型 的根源和实施有效干预，都具有重要的意义。 发明内容 本发明所要解决的技术问题是提供一种与牙本质发育不全II型相关的新的 突变基因及其检测方法。 本发明所提供的牙本质发育不全II型新的突变基因是DSPP基因的第3外显 子/3内含子的剪切供点旁侧A→G的改变。 结果，3外显子/3内含子的剪切供点GT旁侧另外产生新的剪切供点GT序 列。 上述蒙古族牙本质发育不全II型基因检测技术与方法是采用套叠式方法设 计引物逐步测序，并将家系受累与非受累成员之间、与300例蒙古族同民族无血 缘正常对照组之间、与300例汉族无血缘正常对照组之间进行比较分析。 含有上述与牙本质发育不全II型的新的突变基因的表达载体、细胞系及工程 菌也属于本发明的保护范围。本专利提供的各种图片也属于本发明的保护范围。 本发明以蒙古族五代患有牙本质发育不全II型的大家系为研究对象，得到了 与牙本质发育不全II型基因的新的突变位点以及检测方法。研究表明该基因是 蒙古族牙本质发育不全II型的致病基因。该基因是在DSPP基因的第3外显子和 第3内含子的剪切供点旁侧的腺嘌呤被鸟嘌呤核苷酸取代，即发生A→G改变， 结果导致剪切供点GT的旁侧又产生GT序列，致使一方面影响剪切位点，另一 方面又产生了剪切位点GT。从而导致蒙古族家系牙本质发育不全II型临床表 型。 牙本质发育不全II型属常染色体显性遗传病。群体中男女发病机会均等。 本发明提供的牙本质发育不全II型的新的突变基因及其检测方法对该类疾病的 婚前遗传咨询、产前诊断以及症状前诊断、个体化生物药品的开发等方面具有 重要的现实意义和潜在的应用意义。 附图说明 图1蒙古族牙本质发育不全症的系谱图； 图2先证者牙齿X线全景曲面断层片和照片图； 图3患者IV2的牙齿X线全景曲面断层片和数码相片图； 图4患者V7的全口牙位曲面体层片和数码相片图； 图5患者V4的全口牙位曲面体层片和数码相片图； 图6患者IV7的全口牙位曲面体层片和数码相片图； 图7DSPP基因的突变位点。 具体实施方式 第一种实施例：牙本质发育不全II型的新的突变基因及其检测方法的获得 1、样本选择 研究样本来自蒙古族大家系。蒙古族长期以放牧为主要生活方式，由于地理 环境及民俗等原因形成一个相对隔离人群，从而导致遗传性状多样性和特殊的 疾病谱。先证者由遗传门诊发现并由口腔科确诊为牙本质发育不全II型。对其 家系64名现生存成员进行现场调查，绘出本家系系谱图(见图1)，填写牙本质 发育不全有关调查表以及知情同意书。其中48名主要成员进行详细身体检查(如 一般情况、B超、心电图、牙齿、耳聋、骨骼发育等相关症状的检查)，家系患 者均表现为牙本质发育不全II型的典型特点，不伴有耳聋和骨骼发育异常等症 状。选择5名患者拍摄X线全景曲面断层片和数码相片拍摄(见图2-6)。本病 在该家系已传5代，家系成员共72名，其中8名成员已死亡。该蒙古族牙本质 发育不全II型家系共有患者26名，男性13名(4名已死亡)，女性13名。患者 最高年龄58岁，最小4岁。家系成员身体素质和饮食正常。 2、研究样本的特征 研究样本为蒙古族五代患有牙本质发育不全II型的大家系，现有受累成员 22例，其中男9例，女13例。该样本中的受累成员均表现牙本质发育不全II型 的特点，乳牙和恒牙均为受累，受累程度普遍较严重，但患者不同个体之间临 床表现存在差异。图1中，五代牙本质发育不全II型家系系谱中：为先证者； ■为牙本质发育不全II型男性受累者；●为牙本质发育不全II型女性受累者； □男性表型正常者；○女性表型正常者；表示已死亡。 (1)先证者特征 先证者(V6)，女，15岁。由于牙齿呈半透明的黄褐色，磨损程度严重，影 响咀嚼及美观，要求诊治。患者为足月顺产，母亲妊娠期间未患任何疾病，出 生后6个月乳牙萌出，之后牙齿逐渐变黄变小，6岁时恒牙萌出，仍为黄褐色， 并逐渐变小变短。体检发现患者生长发育智力正常，无听力障碍，没有长骨的 多发性骨折及关节松弛等成骨发育不全症状。X线全景曲面断层片显示牙冠呈球 形，牙根变细，髓室和根管变小或完全闭塞，全口恒牙可见不同程度过度磨损 (见图2)，诊断为牙本质发育不全II型。 (2)受累者的临床表现 对家系受累者观察可见，临床症状与先证者相似，即患者牙冠从灰色到棕黄 色不等，釉质易剥脱，牙本质暴露后磨耗迅速，可累及乳牙和恒牙。图3、4、 5、6患者X线全景曲面断层片和对应的照片显示全部或部分牙冠呈球形，牙根 变细，髓室和根管变小或完全闭塞，全口牙齿严重磨损。该家系不同患者的牙 齿的颜色、磨损成度、受累的数量和位置等不相同，临床表型存在异质性(见 图3、4、5、6)。 (3)该家系的特征性 经调查，该家系5代72名成员中，有26人患该病(见系谱图1)，其中女性 患者13名，男性患者13名(死亡4人)，患者子女的发病率接近1/2，无论男 性患者或女性患者的子代中的发病情况未表现出性别差异，且家系中连续几代 都出现患者，其传递方式符合孟德尔遗传规律，属常染色体显性遗传病。 3、与牙本质发育不全II型的新的突变基因及其检测方法的获得 应用聚合酶链反应产物直接测序方法，分析DSPP基因第1～5外显子及其 旁侧核苷酸序列。根据GenBank数据，套叠式方法设计扩增1-5外显子所需引 物(见表1)，以基因组DNA为模板，应用PCR扩增方法扩增先证者V6和患者 V4、V7与家系中表型正常者V3、IV16、IV17的DSPP基因第1、2、3、4、5 外显子及其旁侧核苷酸序列，PCR产物直接测序确定其组成及突变碱基部位，其 中，PCR反应体系(25uL)：基因组DNA0.05-010ug，正反向引物各4pmol，dNTP 各2mmol/L，5uL 5×缓冲液(Tris-HCl 10mM Ph8.0，2mmol/L MgCl 2，5mmol/L KCl)，Taq DNA聚合酶0.5单位(上海华夏公司产品)；PCR扩增参数：94℃预 变性5min后按“94℃/30s-表1中的相应退火温度/30s-72℃/30s”程序，进行 35个循环，72℃再延伸5min。各外显子特异引物及退火温度如表1。PCR产物 经羟基磷灰石柱层析(Qiaquick Purification Kit，Germany)纯化，应用双 脱氧末端终止法分析核苷酸序列(北京奥科生物科技公司)，测定结果与GenBank 数据库相应序列比对，确定突变碱基位置及类型。 表1突变检测引物序列及退火温度 PCR产物测序结果与GenBank序列比对，结果显示表型正常者EDA基因外 显子1、2、3、4、5序列与GenBank给定序列完全一致。而牙本质发育不全II 型患者与家系中正常表型者比较，患者DSPP基因的第3外显子和第3内含子的 剪切供点旁侧的腺嘌呤被鸟嘌呤核苷酸取代，即发生A→G改变(图7)，结果 导致剪切供点GT的旁侧又产生GT序列，致使一方面影响剪切位点，另一方面 又产生了另外剪切位点GT。图7中A为正常表型者，DSPP基因第三外显子/第 三内含子剪切供点及旁侧序列为GTAT；而先证者及患者DSPP基因第三外显子 /第三内含子剪切供点及旁侧序列为GTGT(见图B)；箭头示突变位点，＊示剪 切供点。将第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧A→G改变的DSPP基因命 名为NMXH-08-01，结果导致一方面影响剪切位点，另一方面又产生了剪切位 点GT序列。从而导致蒙古族家系牙本质发育不全II型临床表型。 第二种实施例：家系中DSPP基因第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧 A→G改变与表型共分离的确认。 1、以现生存的其余19例患者的基因组DNA为模板，在正向引物： aagaaccttttcaatagccagt和反向引物tggagaagttaatggaatgtagcaac的引导下按照实施例1 的方法进行聚合酶链反应，应用双脱氧末端终止法分析PCR产物的核苷酸序列 (北京奥科生物科技公司)结果表明家系中(除实施例1中的三个患者)所有 19例受累者第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧A→G改变，并均为杂合型， 一致率为100％。 2、家系中选取正常主要成员23名的基因组DNA为模板，在正向引物： aagaaccttttcaatagccagt和反向引物tggagaagttaatggaatgtagcaac的引导下按照实施例1 的方法进行聚合酶链反应，应用双脱氧末端终止法分析PCR产物的核苷酸序列 (北京奥科生物科技公司)结果表明家系中所有23例非受累者第三外显子/第 三内含子剪切供点旁侧序列未改变，即GTAT序列，一致率为100％。 3、选取300例与疾病家系无血缘关系且牙齿发育正常的健康蒙古族收试者， 按照步骤1的方法对其基因组DNA进行聚合酶链反应，，并对PCR产物应用双脱 氧末端终止法进行测序，结果表明与疾病家系无血缘关系且牙齿发育正常的蒙 古族人群DSPP基因第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧序列未改变，即 GTAT序列，一致率为100％。 4、DSPP基因第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧A→G改变的民族差 异性 为确定DSPP基因第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧A→G突变作为 基因诊断的可能性、准确性和可行性，比较了汉、蒙族间该位点核苷酸种类。 选取300例牙齿发育表型正常的汉族健康受试者(取自北京市房山区第一医院， 男女各半)按照步骤1的方法对其基因组DNA进行聚合酶链反应，并对PCR产 物应用双脱氧末端终止法进行测序。基因序列分析结果表明，健康受试者DSPP 基因第三外显子/第三内含子剪切供点旁侧序列未改变，即GTAT序列，一致 率为100％。 本发明提供的与牙本质发育不全II型的新的突变基因及其检测方法可应用 于婚前遗传咨询：基于DNA的产前诊断以及症状前诊断，可减少受累者和并开 发个体化生物药品，达到提高人口素质的目的。