抗OX40L抗体及其使用方法无效专利 发明

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发明领域 本发明一般意义上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及抗 OX40L抗体及其用途。 发明背景 人OX40配体(OX40L)，一种膜结合的肿瘤坏死因子超家族成员，主要 在活化的抗原呈递细胞例如树突状细胞上表达，在B细胞表达程度稍低。参 见Sugamura，K等人，Nature Reviews Immunology 4：420(2004)；Weinberg AD， Trends Immunol.23(2)：102(2002)。OX40L，亦称为ACT-4受体，TNF4-Human， GP34和CD134L，结合OX40受体(OX40)，所述OX40受体又称为CD134， ACT-4，CD134抗原，ACT35抗原和TNR4-Human。OX40是一种T细胞活化蛋 白，在T细胞受体(TCR)参与后表达。CD40通过活化抗原呈递细胞的参与 增加OX40L的表达。OX40通过OX40L的参与对效应T细胞是共刺激性的，该 共刺激上调T辅助细胞1和T辅助细胞2的细胞因子产生。OX40-OX40L相互作 用对记忆T细胞的产生也很重要，在抗原致敏后促进效应T细胞的存活。在动 物模型中体内阻断OX40L降低类风湿性关节炎、实验性自身免疫病(EAE)、 急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、炎症性肠病、实验性利什曼病和胶原诱 导的关节炎的严重程度。参见Sugamura，K等人，Nature Reviews Immunology 4：420(2004)；Weinberg AD，Trends Immunol.23(2)：102(2002)。 抗-OX40L和识别OX40L的抗体在下面提及，例如WO 95/12673；WO 95/21915；WO 99/15200；Baum，P.R.，等人，EMBO J.13(1994)3992-4001； Imura，A.，等人，Blood 89(1997)2951-2958；Imura，A.，等人，J.Exp.Med.183 (1996)2185-2195；Kjaergaard，J.，等人，J.Immunol.167(2001)6669-6677；Lane， P.，J.Exp.Med.191(2000)201-206；Mallett，S.，and Barclay，A.N.，Immunol. Today 12(1991)220-223；Mallett，S.，等人，EMBO J.9(1990)1063-1068； Ndhlovu，LC.，等人，J.Immunol.167(2001)2991-2999；Oyhshima，Y.，等人，J. Immunol.159(1997)3838-3848；Rogers，P.R.，等人，Immunity 15(2001) 445-455；Stüber，E.，and Strober，W.，J.Exp.Med.183(1996)979-989；Stüber，E.， 等人，Gastroenterology 115(1998)1205-1215；Takahashi，&.，等人，J.Virol.75 (2001)6748-6757；Takasawa，N.，等人，Jpn.J.Cancer Res.92(2001)377-382； Taylor，L.，and Schwarz，H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67-72；Weinberg， A.D.，等人，Nature Medicine 2(1996)183-189；Weinberg，A.D.，等人，Semin. Immunol.10(1998)471-480；Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(202) 102-109；Wu，T.，等人，Transplant.Proc.33(2001)217-218；Higgins，LM.，等人， J.Immunol.162(1999)486-493；Yoshioka，T.，等人，Eur.J.Immunol.30(2000) 2815-2823；和Wang，Q.，等人Tissue Antigens 64：566-574(2004)。MBL International Corp.(TAG-34)和R and D Corp(克隆159403和159408)商品化供 应小鼠抗人OX40L抗体。 显然仍然需要一种具有临床效果的试剂，所述试剂适合用作治疗剂的开 发。此处描述的发明满足这种需要并提供其它益处。 所有本文引用的参考文献，包括专利申请和出版物，均在此完整引入作 为参考。 发明概述 本发明部分基于各种OX40L结合剂(例如抗体和其片段)的鉴定。OX40L 表现为一种重要的和有利的治疗靶标，本发明提供基于结合OX40L的组合物 和方法。本文描述的本发明OX40L结合剂提供重要的治疗和诊断剂，在针对 与OX40L-OX40受体途径的表达和/或活性相关的病理病症中使用。因此，本 发明提供与OX40L结合有关的方法、组合物、试剂盒和制品。 一方面，本发明提供一种分离的抗OX40L抗体，其中该抗体的全长IgG 形式特异结合人OX40L，其结合亲和力为大约10nM或者更好。如同本领域 已经清楚确定的，可以利用各种测定法中的任意一种检测配体与其受体的结 合亲和力，并以各种数值的术语表示。因此，在一个实施方式中，结合亲和 力可以表示为Kd值并反映内在的结合亲和力(例如，具有最低的亲和力效 果)。通常和优选的，在体外测量结合亲和力，不论是在无细胞或者细胞相 关环境中。本领域已知的多种测定法中的任意一种，包括本文描述的那些， 可用于实现结合亲和力测量，包括，例如，Biacore、放射免疫测定(RIA) 和ELISA。 一方面，本发明提供一种分离的抗体，所述抗体结合OX40L的OX40受 体结合域。在一些实施方式中，分离的抗体结合多肽，所述多肽包含、包括 人OX40L胞外结构域或者由人OX40L胞外结构域组成。 一方面，本发明提供一种分离的抗OX40L抗体，所述抗体与OX40受体 竞争结合OX40L。 一方面，本发明提供一种分离的抗OX40L抗体，所述抗体抑制、降低和 /或阻断OX40L活性。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，所述抗体抑制、降低和/或阻 断T细胞增殖。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，所述抗体抑制、减少和/或阻 断活化T细胞的存活。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，所述抗体抑制、减少和/或阻 断T记忆细胞的IL-2分泌。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，包括：选自由以下序列组成的 组中的至少1种、2种、3种、4种、5种和/或6种高变区(HVR)序列： RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)，RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)，RVSNRFS(SEQ ID NO：3)，KVSNRFS(SEQ ID NO：4)，FQGSHVPYT (SEQ ID NO：5)，SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)，SYWLN(SEQ ID NO：7)， SYWMH(SEQ ID NO：8)，MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)， EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)，GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)和ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，包括：选自由以下序列组成的 组中的至少1种、2种、3种、4种、5种和/或6种高变区(HVR)序列：(a)包 括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)或者RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO：2)的HVR-L1；(b)包括序列RVSNRFS(SEQ ID NO：3)或者 KVSNRFS(SEQ ID NO：4)的HVR-L2；(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5)或者SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)的HVR-L3；(d)包括序列SYWLN (SEQ ID NO：7)或者SYWMH(SEQ ID NO：8)的HVR-H1；(e)包括序列 MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)或者EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO：10)的HVR-H2；和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)或者ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)的HVR-H3。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的轻链可变域： DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKL LIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYT FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)或者 DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIP WTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：14)；和包括具有以下序列的重链可变域： QVQLQQPGAELVRPGASVkLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWI VMIDPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRG RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQ ID NO：15)或者 QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWI GEIDPSNGRTNYNEKFKSKATL.TVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRER SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQ ID NO：16)。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，包括：选自由以下序列组成的 组中的至少1种、2种、3种、4种、5种和/或6种高变区(HVR)序列：(a)包 括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)的HVR-L1或者包括序列 RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)的HVR-L1；(b)包括序列 RVSNRFS(SEQ ID NO：3)的HVR-L2或者包括序列KVSNRFS(SEQ ID NO：4) 的HVR-L2；(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5)的HVR-L3或者包括 序列SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)的HVR-L3；(d)包括序列SYWLN(SEQ ID NO：7)的HVR-H1或者包括序列SYWMH(SEQ ID NO：8)的HVR-H1；(e)包 括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)的HVR-H2或者包括序列 EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)的HVR-H2；和(f)包括序列 GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)的HVR-H3或者包括序列 ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)的HVR-H3。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，包括：选自由以下序列组成的 组中的至少1种、2种、3种、4种、5种和/或6种高变区(HVR)序列：(a)包 括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)的HVR-L1；(b)包括序列 RVSNRFS(SEQ ID NO：3)的HVR-L2；(c)包括FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5) 的HVR-L3；(d)包括序列SYWLN(SEQ ID NO：7)的HVR-H1；(e)包括序列 MIDPSDSETHYNQVFKKD(SEQ ID NO：9)的HVR-H2；和(f)包括序列 GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)的HVR-H3。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链，所述轻链包括选自由以下 序列组成的组中的至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列： RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)，RVSNRFS(SEQ ID NO：3)和 FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5)。在一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序 列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQ ID NO：1)的轻链HVR-L1。在一个实施方式 中，抗体包括具有氨基酸序列RVSNRFS(SEQ ID NO：3)的轻链HVR-L2。在 一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序列FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5)的 轻链HVR-L3。在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链，所述重链包括 选自由以下序列组成的组中的至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列： SYWLN(SEQ ID NO：7)，MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)和 GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)。在一个实施方式中，抗体包括具有 氨基酸序列SYWLN(SEQ ID NO：7)的重链HVR-H1。在一个实施方式中，抗 体包括具有氨基酸序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)的重链 HVR-H2。在一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序列 GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)的重链HVR-H3。在一个实施方式中， 本发明的抗体包括重链和轻链，所述重链包括选自由以下序列组成的组中的 至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列：SYWLN(SEQ ID NO：7)， MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQ ID NO：9)和GRGNFYGGSHAMEY(SEQ ID NO：11)，所述轻链包括选自由以下序列组成的组中的至少1种、至少2种或者 所有3种HVR序列：RSSQSIVHGNGNTYE(SEQ ID NO：1)，RVSNRFS(SEQ ID NO：3)和FQGSHVPYT(SEQ ID NO：5)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的轻链可变域： DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKL LIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYT FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的重链可变 域：QVQLQQPGAELVRPGASVkLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLE WIVMIDPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCI RGRGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQ ID NO：15)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的轻链可变域: DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKL LIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYT FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：13)；和包括具有以下序列的重链可变域： QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWI VMIDPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRG RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQ ID NO：15)。 一方面，本发明提供一种抗OX40L抗体，包括：选自由以下序列组成的 组中的至少1种、2种、3种、4种、5种和/或6种高变区(HVR)序列：(a)包 括序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)的HVR-L1；(b)包括序列 KVSNRFS(SEQ ID NO：4)的HVR-L2；(c)包括序列SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)的HVR-L3；(d)包括序列SYWMH(SEQ ID NO：8)的HVR-H1；(e)包 括序列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)的HVR-H2；和(f)包括序 列ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)的HVR-H3。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括轻链，所述轻链包括选自由以下 序列组成的组中的至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列： RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)，KVSNRFS(SEQ ID NO：4)和 SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)。在一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序列 RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)的轻链HVR-L1。在一个实施方式中， 抗体包括具有氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：4)的轻链HVR-L2。在一个 实施方式中，抗体包括具有氨基酸序列SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)的轻链 HVR-L3。在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链，所述重链包括选自 由以下序列组成的组中的至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列： SYWMH(SEQ ID NO：8)，EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)和 ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)。在一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序 列SYWMH(SEQ ID NO：8)的重链HVR-H1。在一个实施方式中，抗体包括具 有氨基酸序列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)的重链HVR-H2。在 一个实施方式中，抗体包括具有氨基酸序列ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)的 重链HVR-H3。在一个实施方式中，本发明的抗体包括重链和轻链，所述重 链包括选自由以下序列组成的组中的至少1种、至少2种或者所有3种HVR序 列:SYWMH(SEQ ID NO：8)，EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQ ID NO：10)和 ERSPRYFDV(SEQ ID NO：12)，所述轻链包括选自由以下序列组成的组中的 至少1种、至少2种或者所有3种HVR序列:RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：2)，KVSNRFS(SEQ ID NO：4)和SQSTHIPWT(SEQ ID NO：6)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的轻链可变域： DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIP WTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：14)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的重链可变域： QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWI GEIDPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRER SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQ ID NO：16)。 在一个实施方式中，本发明的抗体包括具有以下序列的轻链可变域： DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSP KLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIP WTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：14)；和包括具有以下序列的重链可变域： QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWI GEIDPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRER SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQ ID NO：16)。 如本领域已知，并且在下文中更详细的描述，描绘抗体高变区的氨基酸 位置/边界可能有所变化，取决于所处的情况和本领域已知的不同定义(如下 所述)。位于可变域内的一些位置可以看作混合(hybrid)高变位置，因为在一 组标准下这些位置被认为在高变区内而在一组不同的标准下被认为在高变 区外。在延伸的高变区(如下面的进一步定义)还可以发现一种或者多种这 些位置。 在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是多 克隆抗体。在一些实施方式中，抗体选自由以下抗体组成的组：嵌合抗体， 亲和力成熟的抗体(affinity matured antibody)，人源化抗体和人抗体。在一 些实施方式中，抗体是抗体片段。在一些实施方式中，抗体是Fab，Fab′， Fab′-SH，F(ab′)2或者scFv。 在一个实施方式中，抗体是嵌合抗体，例如，包括从非人供体移植到异 源的非人、人或者人源化序列(例如，骨架和/或恒定区序列)的抗原结合序 列的抗体。在一个实施方式中，非人供体是小鼠。在一个实施方式中，抗原 结合序列是合成的，例如通过诱变获得(例如，噬菌体展示筛选，等等)。 在一个实施方式中，本发明的嵌合抗体具有小鼠V区和人C区。在一个实施 方式中，小鼠轻链V区被融合到人kappa轻链。在一个实施方式中，小鼠重链 V区被融合到人IgG1C区。 本发明的人源化抗体包括在FR中有氨基酸取代的抗体和移植的CDR中 有变化的亲和成熟变异体。CDR或者FR中取代的氨基酸不限于存在于供体或 者受体抗体中的那些。在其它实施方式中，本发明的抗体还包括Fc区氨基酸 残基的变化，这导致提高的效应器功能包括增强的CDC和/或ADCC功能和B 细胞杀伤。本发明的其它抗体包括那些具有提高稳定性的特定变化的抗体。 在其它实施方式中，本发明的抗体还包括Fc区氨基酸残基的变化，这导致降 低的效应器功能，例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或降低的B细胞杀伤。 在一些实施方式中，本发明的抗体的特征为与人补体因子C1q和/或天然杀伤 (NK)细胞上人Fc受体减弱的结合(例如结合的缺失)。在一些实施方式中， 本发明的抗体的特征为与人FcγRI，FcγRIIA和/或FcγRIIIA减弱的结合(例如 结合的缺失)。在一些实施方式中，本发明的抗体属于IgG型(例如，IgG1或者 IgG4)，并在E233，L234，G236，D265，D270，N297，E318，K320，K322，A327， A330，P331和/或P329(根据EU索引编号)中包括至少1个突变。在一些实施方 式中，抗体包括突变L234A/L235A或者D265A/N297A。 一方面，本发明提供抗OX40L多肽，所述多肽包括此处列出的任意一个 抗原结合序列，其中抗OX40L多肽特异结合OX40L。 一方面，本发明提供一种免疫偶联物(可以互换称为“抗体药物偶联物” 或者“ADC”)，所述免疫偶联物包括此处公开的任意一种抗OX40L抗体与试 剂，例如药物的偶联。 本发明的抗体结合(在一些实施方式中，特异结合)OX40L，并且在一 些实施方式中，可以调节与OX40L相关作用的一个或者多个方面，包括但不 限于OX40L活化，OX40L下游分子信号转导，OX40受体活化，OX40受体下 游分子信号转导，OX40受体结合OX40L的破坏，OX40L多聚化，和/或任意 生物学相关的OX40L和/或OX40受体生物学途径的破坏，和/或免疫病症(例 如哮喘，特应性皮炎，过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，移植物抗宿 主疾病(GVHD)和/或系统性红斑狼疮)的治疗或者预防；和/或与OX40L 表达和/或活性(例如增加的OX40L表达和/或活性)相关的病症的治疗或者 预防。在一些实施方式中，本发明的抗体特异结合OX40L。在一些实施方式 中，抗体特异结合OX40L的OX40受体结合区。在一些实施方式中，分离的 抗体结合这样的多肽，所述多肽包含人OX40L胞外结构域，由人OX40L胞外 结构域组成或者基本上由人OX40L胞外结构域组成。在一些实施方式中，抗 体特异结合OX40L，其Kd为大约1nM或者结合力更强。在一些实施方式中， 抗体特异结合OX40L，其Kd为大约10nM或者结合力更强。在一些实施方式 中，本发明的抗体在体内和/或体外降低、抑制和/或阻断OX40L活性。在一 些实施方式中，抗体与OX40L竞争结合OX40受体(减少和/或阻断OX40受体 结合OX40L)。 一方面，本发明提供本发明抗体在制备药物中的用途，所述药物用于病 症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方式中， 所述病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，所述病症是哮喘，特应性皮 炎(atopic dermatitis)，过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/ 或系统性红斑狼疮。在一些实施方式中，所述病症是与病毒、细菌或者其它 感染源相关的疾病，例如病毒诱导的免疫病理状况，例如，流感病毒或者RSV 或者相关病毒感染诱导的病理状况，例如，肺部的疾病。一般参见 US2005/0069548 A1。在有些实施方案中，所述病症是关节炎(急性的和慢 性的，类风湿性关节炎，包括幼发型类风湿性关节炎(juvenile-onset rheumatoid arthritis)和关节炎的各个阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风或痛风性 关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱 发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性 关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎、 变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、绝经期关节炎、雌激 素消减性关节炎、和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)，自身免疫性淋巴细胞 增生性疾病，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑 病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布 氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应 性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮 炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM 综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性 荨麻疹(包括慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮 肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系 统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进行性 MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)MS(RRMS)、进行性系统性 硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic)硬化，视 神经脊髓炎(NMO)，炎症性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免疫 介导的胃肠病、胃肠炎症、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微观 结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎、 和自身免疫性炎症性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬 化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)， 脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学 病症，移植物抗宿主疾病，血管性水肿诸如遗传性血管性水肿，脑神经损伤 像脑膜炎中的，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti)，自身 免疫性早熟性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失，IgE介 导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏 (Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急 性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡 萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小 球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜 性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增 殖性GN(MPGN)(包括I型和II型)、和急进性GN(RPGN)，增殖性肾炎，自 身免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎，龟头包皮 炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，环状肉芽肿， 光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，慢性单纯苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状 鱼鳞癣，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮症，变应性疾患和 应答，食物过敏，药物过敏，昆虫过敏，罕见的过敏性病症诸如肥大细胞增 生病，过敏反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性 掌跖湿疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale)，自身免疫性哮喘，变应性哮喘，和儿科哮喘，涉及T细胞浸润和 慢性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反 应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼 疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑 狼疮、狼疮脱发、SLE(诸如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合 征(NLE)、和播散性红斑狼疮，幼发型(I型)糖尿病包括儿科IDDM，成人 期发作的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病 视网膜病变，糖尿病肾病，糖尿病结肠炎，糖尿病大动脉病症，与细胞因子 和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节 病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病，粒细胞 缺乏，血管炎病包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高 安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节 性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、微观多动脉炎、免疫血管炎、CNS血管炎、 皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎(诸如系统性坏死性血管炎)、 和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)和 ANCA相关小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障 碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血， 溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫 血(anemia pemiciosa)，阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍 (PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，细胞 减少症诸如全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS 炎性病症，阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多器官损 伤综合征诸如那些脓毒症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾 病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，运动神经炎，变应性神经炎， 贝切特氏(Behet)病/综合征，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏 (Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(Sjgren)综合征， 史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类 天疱疮，天疱疮包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮 和红斑性天疱疮，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，由自 身免疫性疾患引起的热伤，先兆子痫，免疫复合物病症诸如免疫复合物肾炎， 抗体介导的肾炎，神经炎性病症，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病 或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓 性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、 和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(包括例如特发性血小板减少性紫癜 (ITP)包括慢性或急性ITP)，巩膜炎诸如特发性角膜-巩膜炎、巩膜外层炎， 睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功 能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎(诸如自 身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto) 甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能 减退症、格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合 征例如I型(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合征 诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton) 综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症 肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征 (OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自身 免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自 身免疫性慢性活动性肝炎，肺炎诸如淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气 管炎(非移植物)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger) 病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性热性嗜中性白细胞皮 肤病，角质层下脓疱皮肤病，一过性棘层松解性皮肤病，硬化诸如原发性胆 汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹腔或腹部疾病， 口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋 白血症诸如混合型冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、 自身免疫性听觉丧失，多软骨炎诸如顽固性或复发的或复发性多软骨炎，肺 泡蛋白沉着症，寇甘氏(Cogan)综合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝耳氏(Bell) 麻痹，斯威特氏(Sweet)病/综合征，自身免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛， 淀粉样变，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋 巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋 白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率 失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性 肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病， 葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛， 多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性 痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德 雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，全秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺 氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女 性自身免疫性不孕不育例如由于抗精虫抗体的，混合性结缔组织病，恰加斯 氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综 合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋 巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤 维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病诸如利什曼病、 锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征， 卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺 间质纤维化，间质性肺纤维化，纤维性纵隔炎，肺纤维化，特发性肺纤维化， 囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑，胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞 性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征， flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急 性或慢性)、或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人 免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，艾柯病毒 感染，脓毒症(系统性炎性应答综合征(SIRS))，内毒素血症，胰腺炎，甲状 腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，风疹病毒感染，种痘后综合征，先天 性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染，腮腺炎，埃文斯(Evans) 综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾 炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉 络膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性超敏感性肺炎，结膜炎，诸如春季卡他、干 燥性角膜结膜炎、和流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病， 良性家族性和缺血-再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节 炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎， 动脉硬化性病症(大脑血管功能不全)诸如动脉硬化性脑病和动脉硬化性视 网膜病，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病， 冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性眼内炎 (endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性小肠炎(enteritis allergica)，麻风 节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿热(febris rheumatica)，哈- 里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿 (haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减退，局限性回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性(traverse)脊髓炎， 原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia symphatica)，肉芽肿 性睾丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症， 奎尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，淋巴滤泡性 胸腺炎，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患， 白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有 关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复 合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原 发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结缔 组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，自身免疫性多腺性综合征， 包括多腺性综合征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心 肌病诸如扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita，EBA)，血色素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎， 化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎 或蝶窦炎，变应性鼻窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺 嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综 合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、 曲霉肿、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，脊椎关节病，血清阴性脊 椎关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性 粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋 白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管 扩张综合征，血管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症:胶原病、风湿 病诸如慢性关节风湿病、淋巴结炎、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑 缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损 伤，缺血再灌注病症，心肌或其它组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎， 炎性皮肤病，具有急性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱病，肾皮质坏 死，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒 细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，发作性睡病，急性重度炎症， 慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜 异位症。其它例子(在有些情况中，涵盖上文所列的)包括但不限于自身免 疫性风湿病学病症(诸如例如类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征、硬皮病、 狼疮诸如SLE和狼疮肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合 征、和银屑病关节炎)、自身免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎症性肠病(例 如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性 肝炎原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎)、血管炎(诸如例如ANCA 相关血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韦格纳氏肉芽肿病、和多动脉炎)、自 身免疫性神经学病症(诸如例如多发性硬化、视性眼阵挛-肌阵挛综合征、 重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、和自身免疫性 多神经病)、肾病症(诸如例如肾小球肾炎、古德帕斯丘氏综合征、和贝格 尔氏病)、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹(urticaria， hives)、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液病学病症 (诸如例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、和 自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力病(诸 如例如内耳病和听力丧失)、贝切特氏病、雷诺氏综合征、器官移植、GVHD、 和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相关自身免疫病诸如胰岛素依赖 性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病、和自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏 病和甲状腺炎))。 一方面，本发明提供包括本发明的一种或者多种抗体和载体的组合物。 在一个实施方式中，载体是药学上可接受的。 一方面，本发明提供编码本发明抗OX40L抗体的核酸。 一方面，本发明提供包括本发明核酸的载体。 一方面，本发明提供包括本发明的一种或者多种核酸和载体的组合物。 在一个实施方式中，载体是药学上可接受的。 一方面，本发明提供包括本发明核酸或者载体的宿主细胞。载体可以是 任意类型，例如重组载体例如表达载体。可以使用各种宿主细胞中的任意一 种。在一个实施方式中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌。在一个实 施方式中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞。 一方面，本发明提供制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供制备抗 OX40L抗体(所述抗体此处定义为包括其全长和片段)的方法，所述方法包 括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体的本发明重组载体，并回收所述抗 体。 一方面，本发明提供一种包括容器的制品；和包含在容器中的组合物， 其中组合物包括本发明的一种或者多种抗OX40L抗体。在一个实施方式中， 组合物包括本发明的核酸。在一个实施方式中，包含抗体的组合物还包括载 体，所述载体在一些实施方式中是药学上可接受的。在一个实施方式中，本 发明的制品还包括用于给患者施用组合物(例如，抗体)的说明书(例如用 于此处描述的任意一种方法的说明书)。 一方面，本发明提供一种包括第一容器和第二容器的试剂盒，所述第一 容器包括包含本发明一种或者多种抗OX40L抗体的组合物，所述第二容器包 含缓冲液。在一个实施方式中，缓冲液是药学上可接受的。在一个实施方式 中，包括抗体的组合物还包括载体，所述载体在一些实施方式中是药学上可 接受的。在一个实施方式中，试剂盒还包括用于给患者施用组合物(例如， 抗体)的说明书。 一方面，本发明提供本发明的抗OX40L抗体在制备药物中的用途，所述 药物用于病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实 施方式中，病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性 皮炎，过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼 疮。 一方面，本发明提供本发明的核酸在制备药物中的用途，所述药物用于 病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方式中， 病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性皮炎，过敏 性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼疮。 一方面，本发明提供本发明的表达载体在制备药物中的用途，所述药物 用于病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方 式中，病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性皮炎， 过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼疮。 一方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物 用于病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方 式中，病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性皮炎， 过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼疮。 一方面，本发明提供本发明的制品在制备药物中的用途，所述药物用于 病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方式中， 病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性皮炎，过敏 性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼疮。 一方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用 于病症的治疗性和/或预防性治疗，所述病症例如免疫病症。在一些实施方式 中，病症是自身免疫病症。在一些实施方式中，病症是哮喘，特应性皮炎， 过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬化，GVDH和/或系统性红斑狼疮。 本发明提供用于调节与OX40L的表达和/或活性相关的疾病状态的方法 和组合物，所述疾病状态例如与增加的表达和/或活性或者不希望的表达和/ 或活性相关的疾病状态。 本发明的方法可作用于任意合适的病理状态。示范性的病症在本文中描 述，包括免疫病症。 本发明的方法还包括额外治疗步骤。一方面，本发明提供包括给药有效 量的抗OX40L抗体以及有效量的另一种治疗剂的方法。例如，在一个实施方 式中，该方法还包括另外的步骤，其中靶细胞和/或组织接受类固醇处理。抗 OX40L抗体可以与另一种治疗剂在同一组合物或者分离的组合物中顺序或 者共同给药，所述治疗剂对那些目的是有效的。抗OX40L抗体和另外的治疗 剂的给药可以同时进行，例如，作为单一组合物或者作为两种或更多种不同 的组合物，利用相同的或者不同的给药途经。可选地，或者另外，给药可以 采用任何顺序连续进行。可选地，或者另外，可以采用任意次序顺序组合给 药或同时组合进行给药。在某些实施方式中，两种或更多种组合物给药之间 可以存在从数分钟到数天、数周到数月的间隔。例如，可以首先给药另一种 治疗剂，然后给药抗OX40L抗体。但是，还希望同时给药抗OX40L抗体或者 首先给药抗OX40L抗体。在某些实施方式中，两种或更多种组合物给药之间 可以存在从数分钟到数天、数周到数月的间隔。 另一方面，本发明提供用于OX40L检测的方法，该方法包括检测样品中 的OX40L-抗OX40L抗体复合物。本文使用的术语“检测”包括参考对照或者 不参考对照的定性和/或定量检测(测量水平)。 另一方面，本发明提供诊断与OX40L表达和/或活性相关的病症的方法， 该方法包括检测生物样品中的OX40L-抗OX40L抗体复合物，所述生物样品 来自患有或者怀疑患有所述病症的患者。在一些实施方式中，OX40L表达是 增加的表达或者异常的表达。在一些实施方式中，所述病症是免疫病症。 另一方面，本发明提供任意一种本文描述的抗OX40L抗体，其中抗 OX40L抗体包括可检测的标记。 另一方面，本发明提供本文描述的任意一种抗OX40L抗体和OX40L的复 合物。在一些实施方式中，复合物是体内或者体外的。在一些实施方式中， 抗OX40L抗体被可检测的标记。 附图简述 图1A和1B：显示小鼠抗人OX40L单克隆抗体8E12可变区的氨基酸序列。 A，8E12轻链可变区(SEQ ID NO：13)。B，8E12重链可变区(SEQ ID NO：15)。 根据Kabat编号氨基酸。 图2A和2B：显示小鼠抗人OX40L单克隆抗体13G5可变区的氨基酸序 列。A，13G5轻链可变区(SEQ ID NO：14)。B，13G5重链可变区(SEQ ID NO：16)。根据Kabat编号氨基酸。 图3：图解显示抗OX40L单克隆抗体8E12和13G5的给药竞争性抑制人 OX40受体与人OX40L的结合。 图4：图解显示在基于细胞的测定中抗OX40L单克隆抗体8E12和13G5的 给药抑制T细胞增殖。 图5：图解显示抗OX50L单克隆抗体8E12和13G5的给药抑制T记忆细胞 的IL-2产生。 图6：图解显示抗OX40L单克隆抗体8E12和13G5的给药抑制活化的T细 胞的存活。 发明详述 本发明此处提供抗OX40L抗体，其可用于，例如，与OX40L的表达和/ 或活性相关的疾病状态的治疗或者预防，所述疾病状态例如与增加的表达和 /或活性或者不希望的表达和/或活性相关的疾病状态。在一些实施方式中， 本发明的抗体用于治疗免疫病症(例如哮喘，特应性皮炎，过敏性鼻炎，炎 症性肠病，多发性硬化，GVHD和/或系统性红斑狼疮)。 另一方面，发现本发明的抗OX40L抗体可用作OX40L检测和/或分离的 试剂，例如OX40L在不同组织和细胞类型中的滞留。 本发明还提供制备抗OX40L抗体、编码抗OX40L抗体的多核苷酸和包含 编码抗OX40L抗体的多核苷酸的细胞的方法。 通用技术 本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理 解，而且通常是本领域技术人员常规采用的，诸如例如以下文献记载的广泛 应用的方法：Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.； CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel，et al. eds.，(2003))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)： PCR2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R. Taylor eds.(1995))，Harlow and Lane，eds.(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed. (1987))。 定义 “分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的 抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物 质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的 实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最 优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N- 末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的 SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境 的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然 而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。 “分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关 联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自 然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时 的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所 包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它 在天然细胞中的染色体定位时。 术语“依照Kabat的可变域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及 其变体指Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed. Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中的 抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际 的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩 短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照 Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、 82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat 编号序列对比同源区来确定。 “结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体 (例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于 本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互 作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd) 来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。 低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更 快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的 多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实 施方案。 在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所 述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA) 来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I 标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗 原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了确定 测定条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs) 包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在室温 (约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM [125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res.57： 4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab保温 过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。此后， 将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，并用 含0.1％ Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液 (MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数 10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合 测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使 用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使 用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应 商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分 钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入 1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟 的流速注入在含0.05％ Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab (0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速 率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen， Y.，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测 定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定， 即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计 (ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件 下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强 度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。 依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate) 或“kon”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcoreTM-2000 或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用固定化抗原CM5 芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸 N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠 pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得 约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未 反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％ Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单 一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解 离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，Y.，et al.，J Mol Biol 293： 865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超 过106M-1S-1，那么结合速率优选使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计 诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列 SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在 浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式) 在25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或 降低。 术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分 子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。 另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA 区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制 (例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例 如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组 中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连 接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载 体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明 书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。 “多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合 物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修 饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者 通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸， 诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装 配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸 可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例 如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如 例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例 如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例 如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基 异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。 另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷 酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸 的别的连接，或者可偶联至固体和半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或 者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准 保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似 物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖 类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、 呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。 可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但 不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二 硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO 或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未 取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯 基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描 述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。 “寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合 成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷 酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。 术语“OX40配体”(可互换的称为“OX40L”)，在用于本文时，除非另有 明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合 成的)OX40L多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例 如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存 在的等位变体。术语“野生型OX40L”一般指包含天然存在OX40L蛋白的氨基 酸序列的多肽。术语“野生型OX40L序列”一般指在天然存在OX40L中找到的 氨基酸序列。 术语“OX40受体”(可互换的称为“OX40”)，在用于本文时，除非另有 明确说明或者上下文另有说明，指任何天然的或变异的(无论是天然的或合 成的)OX40多肽。术语“天然序列”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式(例 如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存 在的等位变体。术语“野生型OX40”一般指包含天然存在OX40蛋白的氨基酸 序列的多肽。术语“野生型OX40序列”一般指在天然存在OX40中找到的氨基 酸序列。 术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如 全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双 特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗 体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和 力成熟的。 术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每 种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分 布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区 (CDR)或高变区的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然 重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形 成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条 链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成 抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD. (1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能， 诸如抗体依赖性细胞的(细胞)毒性中抗体的参与。 用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段， 各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于 结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点 且仍能够交联抗原。 “Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类 中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体 组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽 接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结 合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表 面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别 和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。 Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与 Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括 来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱 氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′ 片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化 学偶联。 根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋 白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。 根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球 蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同 种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球 蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚 基结构和三维构造是众所周知的。 “抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存 在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体 片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体 分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包 含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案 中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体 中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、 ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整 抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂 且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。 术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高 度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个 在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖 许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且 是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。 Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917 (1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到 Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)”高变区是以对 可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。 高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36(L1)、46-56(L2)和 89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、47-66或49-66或50-66(H2)和93-101或93-102 (H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等，见上文编号的。 “框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些 残基。 非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球 蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体 抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体 抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。 在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。 此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这 些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一 个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于 非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的 FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免 疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)； Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol. 2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem. Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech. 5：428-433(1994)。 “嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物 种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余 部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相 同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国 专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855 (1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。 “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域 存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽 接头，使得scFv能够形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见 Pluckthun，在Rosenburg and Moore编的《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》第113卷中，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。 “抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合 物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选的是，靶 抗原是多肽。 术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片 段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。 通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些 结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体 更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：6444-6448(1993)。 “人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/ 或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种 定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。 “亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改 变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的 抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原 的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.， Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和 力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变:Barbas et al.，Proc. Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155 (1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896 (1992)。 抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列 变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包 括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的 细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B 细胞活化。 “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒 性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc 受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗 原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm) 细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞， NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上 的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸 如美国专利No.5,500,362或5,821,337或Presta美国专利No.6,737,056中所记 载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然 杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动 物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。 “人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选 的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白 细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、 细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其 天然来源分离，例如血液。 “Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人 FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII 和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受 体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨 基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域 中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质 结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述 Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet， Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34 (1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文 中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体， FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976) 和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的动态平衡。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入 该专利出版物的内容作为参考。还可参见Shields et al.，J.Biol.Chem. 9(2)：6591-6604(2001)。 测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期， 例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc 变体多肽的灵长类动物中。 “补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补 体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合其关联抗原所结合的抗体 (适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如 Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。 具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体 记载于美国专利No.6,194,551B1和WO 99/51642。在此明确收入那些专利出 版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184 (2000)。 “阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学 活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学 活性。 “病症”或“疾病”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾 患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症 的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括哮喘、特应性皮炎、 变应性鼻炎(allergic rhinitis)、炎症性肠病、多发性硬化(multiple sclerosis)、 和系统性红斑狼疮。 “自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或紊 乱或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。在这些自身免疫病和 炎症紊乱的许多例子中，可以存在许多临床和实验室标志，包括但不限于： 高丙种球蛋白血症、高水平自身抗体、组织中抗原-抗体复合物沉积、得益 于皮质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋巴样细胞集合体。 在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进 程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望 效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病 理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。 在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。 “个体”指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限 于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、 小鼠和大鼠。 为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜 和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、等。优选的是， 哺乳动物指人。 “有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的 量。 本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体 的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引 发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮 抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需 的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂 量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于 治疗有效量。 术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞 破坏的物质。该术语意图包括:放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、 Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶 呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长 春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星 (doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶 核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源 的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。 下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。 “化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类 (alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺 (cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯 佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派 (uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包 括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布 拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌 (lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan) ()、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰 喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)； callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和 比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸 (podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是 隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物， KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin； 海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫 司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮 芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲 磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸 如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、 洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素 类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是 加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33： 183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素 (esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类 抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴 霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素 (carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素 (daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代 多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索 比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉 素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素 (nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、 嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链 黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美 司(ubenimex)、净司他丁(zinostain)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸 如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物， 诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、 双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨 (enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、 丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷 (mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂， 诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷 (aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶 (eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙 (edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌 (diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)； 依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼 达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine) 和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米 托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司 他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌 (losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素 (rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸 (tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2＂-三氯三乙胺；单端孢菌素类 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)( )；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘 露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)； gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇 (taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳 米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois) 和多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)； 苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)()；6-硫鸟嘌 呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似 物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)()； 铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌 (mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)()；奥沙利铂(oxaliplatin)； 亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)()；能灭瘤 (novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟 甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他 滨(capecitabine)()；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物； 以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春 新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM) 联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。 该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效 果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实 例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔 芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、 屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬 (toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵 巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如和 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗 雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特 (bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制 剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地 孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦 (formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、 来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种 定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如 或)、依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、 唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、 阿伦膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、替 鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨 (troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑 制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如 PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如 疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH； lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为 GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。 “生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达 OX40L的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低 处于S期的细胞(诸如表达OX40L的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例 子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞 和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vircas)(长春新碱 (vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制 剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、 依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S 期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、 达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲 氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见 《(The Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel) 和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西 他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微 管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。 “多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是 (8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四 氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。 (8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，1 0-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedi one 含“Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素(见下文定 义)。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如 在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明 包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的 多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。 本发明的组合物及其制备方法 本发明涵盖包含抗OX40L抗体的组合物，包括药用组合物；及包含抗 OX40L抗体编码序列的多核苷酸。在用于本文时，组合物包含一种或多种结 合OX40L的抗体，和/或一种或多种包含编码一种或多种结合OX40L的抗体 的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受 的赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域众所周知的。 本发明还涵盖分离的抗体和多核苷酸的实施方案。本发明还涵盖基本上 纯的抗体和多核苷酸的实施方案。 本发明的抗OX40L抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所 提供的抗OX40L抗体的Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)2。这些抗体片段可通过常 规方法来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片 段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。 单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体 相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。由此，修饰语“单克 隆”指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。 本发明的抗OX40L单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.，Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国 专利No.4,816,567)来制备。 在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发 生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋 白质。OX40L的抗体一般通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射OX40L 和佐剂来生成。OX40L可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方 法在本文中有描述。例如，OX40L的重组生产在下文中有描述。在一个实施 方案中，将动物用包含OX40L胞外结构域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重链 Fc部分的OX40L衍生物免疫。在一个优选的实施方案中，将动物用 OX40L-IgG1融合蛋白免疫。通常将动物针对OX40L的免疫原性偶联物或衍 生物和单磷酰脂质A(MPL)/海藻糖trehalose dicrynomycolate(TDM)(Ribi Immunochem.Research，Inc.，Hamilton，MT)进行免疫，将溶液皮内注射于多 个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并测定抗 OX40L滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。 或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二 醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。 将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优 选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如， 若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或 HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷 (HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。 优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水 平生成抗体、并对诸如HAT培养基样培养基敏感的。在这些细胞中，优选的 骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21 和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生 的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体 (Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。 可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对OX40L的单克隆抗体 的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测 定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆 抗体的结合特异性。 单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem. 107：220(1980)的Scatchard分析来测定。 在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细 胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养 (Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。 另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。 可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰 石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、 腹水或血清适当分开。 本发明的抗OX40L抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的合成 抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所 述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的 噬菌体。通过针对所需抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合 所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。 然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进 一步富集。本发明的任何抗OX40L抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛 选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv 序列和Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3中记载的合适 的恒定区(Fc)序列构建全长抗OX40L抗体克隆。 抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重 链(VL)和轻链(VH)，都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以 功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段(其中VH和VL通过 短的、柔性的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其中它们各自与恒定域融 合且非共价相互作用)，如Winter et al.，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994) 所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称 为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。 VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬 菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter et al.，Ann.Rev. Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有 高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为 广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如 Griffiths et al.，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以 以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序 列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。 通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体 片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同 一多肽链上相连，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述， 或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链分泌到细菌宿主细胞 周质中，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展 示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom et al.，Nucl.Acids Res.，19：4133-4137 (1991)所述。 一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核 酸。如果希望文库偏向抗OX40L克隆，那么可以给受试者免疫OX40L以产生 抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于 文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗人OX40L克隆的人 抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性 内源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗人OX40L抗体应答，使得OX40L 免疫产生生成针对OX40L的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生 成在下文中有描述。 可以如下获得抗OX40L反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选 规程来分离表达OX40L特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用OX40L亲和 层析进行的细胞分离或者细胞对荧光标记的OX40L的吸附及后续的荧光激 活细胞分选(FACS)。 或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可 能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用OX40L在其中没有抗原性的动物 (人或非人的)物种构建抗体文库。为了构建掺入体外抗体基因的文库，从 受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物 物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和禽类 等)获得感兴趣的免疫细胞。 从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核 酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从 淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′ 末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。 可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外 显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi et al.(1989)和Ward et al.， Nature，341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还 可基于前导外显子内，如Jones et al.，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向 引物基于恒定区内，如Sastry et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732 (1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi et al. (1989)或Sastry et al.(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使 用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可 获得的VH和VL重排，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)或 Orum et al.，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)所述。为了将所扩增的 DNA克隆到表达载体中，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为 标签，如Orlandi et al.(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩 增，如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述。 人工合成的重组的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人 VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson et al.，J.Mol.Biol.，227：776-798 (1992))，并定位(Matsuda et al.，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区 段(包括H1和H2环的所有主要构型)可用于生成多样性VH基因全集，用到 编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom and Winter，J.Mol. Biol.，227：381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中 于单一长度的长H3环，如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89： 4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams and Winter， Eur.J.Immunol.，23：1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。 基于一系列VH和VL折叠的范围及L3和H3长度的合成的V基因全集将编码 具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V 基因区段。 抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在 一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe et al.，Gene，128：119-126(1993)所述，或者在体内外通过组合感染来重组载 体，例如Waterhouse et al.，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP 系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施 加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另 一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细 胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制(约1012 个克隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制 子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和 力(Kd-1为约10-8M)的多样性抗体。 或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas et al.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后 克隆，如Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用于 将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。 在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与 VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton et al.，Nucl.Acids Res.，20： 3831-3837(1992)所述。 未免疫文库(naive library)(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲 和力(Kd-1为约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建 和再次选择次生文库，如Winter et al.(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins et al.，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)的方法或Gram et al.，Proc.Natl.Acad. Sci USA，89：3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突 变(Leung et al.，Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或 多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴 趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754 (公开于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导 诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出 的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体组合，并在数 轮链改组中筛选更高亲和力，如Marks et al.，Biotechnol.，10：779-783(1992) 所述。此技术容许生成亲和力在10-9M范围的抗体和抗体片段。 编码OX40L的核酸序列可以使用所需OX40L区域，例如胞外结构域的氨 基酸序列来设计。或者，可以使用cDNA序列(或其片段)。别的OX40L序列 进一步披露于例如SwissProt登录号P23510。编码OX40L的DNA可以通过本领 域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels et al.，Agnew. Chem.Int.Ed.Engl.，28：716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷 酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个 实施方案中，编码OX40L的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码 子。或者，编码OX40L的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。 构建编码OX40L的DNA后，将DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表 达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识 别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的 物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的 蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的， 有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细 胞生物体诸如哺乳动物的细胞。 任选的是，编码OX40L的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达 产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stII、ecotin、 lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和α-因子。适用于此处的还有 蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen et al.，EMBO J.，4：3901(1985))。 宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常 规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编 码所需序列的基因而适当修改。 转染指宿主细胞摄取表达载体，无论编码序列事实上是否表达。本领域 普通技术人员直到许多转染方法，例如CaPO4沉淀和电穿孔。若宿主细胞内 存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众 所周知的，有些在本文中有描述。 转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外 元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准 技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。 用于生成OX40L的原核宿主细胞可以如Sambrook et al.，见上文一般所 述进行培养。 用于生成OX40L的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培 养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。 此公开书中涉及的宿主细胞涵盖体外培养的细胞以及宿主动物内的细 胞。 OX40L的纯化可以使用本领域公认的方法来实现。 纯化的OX40L可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻 璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚 甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克 隆的亲和层析分离。OX40L蛋白对基质的附着可以通过Methods in Enzymology，vol.44(1976)中记载的技术来实现。将蛋白质配体附着于多糖基 质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术牵涉用卤化氰活化载体，随 后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化后的基质。 或者，OX40L可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表 达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或 者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。 在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接 触固定化的OX40L。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件 来模拟生理学条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如 如Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用 碱洗脱，例如如Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者通过 OX40L抗原竞争洗脱，例如在与Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991) 的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此 外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。 选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬 菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结 合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中 的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体， 而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和 力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass et al.，Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如 Marks etal.，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。 有可能在对OX40L具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是 亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机诱变(例如如有些上文所述亲和 力成熟技术进行)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的 亲和力。通过限制OX40L，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所 有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化OX40L一起温育， 但是生物素化OX40L的摩尔浓度低于OX40L的目标摩尔亲和常数。然后用链 霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依 照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分 离出亲和力低得只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的 噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。 抗OX40L克隆可以进行活性选择。在一个实施方案中，本发明提供了阻 断OX40受体与OX40L之间的结合但不阻断OX40与第二蛋白质结合的抗 OX40L抗体。对应于此类抗OX40L抗体的Fv克隆可以如下选出：(1)如上所 述从噬菌体文库分离抗OX40L克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养来 扩增所分离的噬菌体克隆群；(2)选出分别想阻断和不阻断其活性的OX40L 和第二蛋白质；(3)使抗OX40L噬菌体克隆吸附至固定化的OX40L；(4)使 用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识别OX40L结合决定簇(其与第 二蛋白质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸 附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可以通过一次或多 次重复本文所述选择规程来进一步富集。 编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使 用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特 异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA 置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的 宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞 或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码 抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr. Opinion in Immunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151 (1992)。 编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知 DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat et al.，见上文)以形成编码全 长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此 目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任 何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与另 一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序 列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一个优选的实 施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人 的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。 还可以修饰编码衍生自本发明杂交瘤的抗OX40L抗体的DNA，例如通 过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替衍生自杂交瘤抗体的同源 鼠源序列(例如如Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855 (1984)中的方法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的 DNA，通过共价接合免疫球蛋白编码序列或非免疫球蛋白多肽的整个或部分 编码序列。可以以该方式制备具有本发明的Fc克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的 结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。 抗体片段 本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体 有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。 已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化 完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81 (1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv 抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大 量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直 接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.， Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细 胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半 衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的 其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗 体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及 5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此， 它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应 物蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering， Borrebaeck编，supra。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No. 5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。 人源化抗体 本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。 例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非 人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可 遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature 321：522-525 (1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此， 此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的 人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人 抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残 基替代。 用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是 非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列 对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序 列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)； Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重 链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用 于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285 (1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。 更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生 物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序 列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化 抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还 可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机 程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中 的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样， 可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特 征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉 及对抗原结合的影响。 人抗体 本发明的人抗OX40L抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展 示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂 交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗OX40L抗体。用于生成人单克隆抗体的 人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.， 133:3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及Boerner et al.，J.Immunol.，147：86(1991). 例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫 后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合 和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的 完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在 抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immunol.7：33(1993)。 基因改组也可用于在体外自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中 人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为 “表位印记”(epitope imprinting)，如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗 体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链 scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分 离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合 位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶体的选择。在重复该过程以替 换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公开于1993年4月1 日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完 全人的抗体，它们不含非人起源的FR架或CDR残基。 还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610 和5,229,275)。 双特异性抗体 双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优 选人抗体或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对OX40L，另一结合 特异性针对任何其它抗原。例示性的双特异性抗体可结合OX40L蛋白质的两 种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达OX40L的细胞。 这些抗体拥有OX40L结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素 -α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原) 的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性 抗体)。 用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗 体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有 不同的特异性(Millstein and Cuello，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白 重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不 同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通 过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程 披露于WO 93/08829，公开于1993年5月13日及Traunecker et al.，EMBO J. 10：3655(1991)。 依照一种不同且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结 合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至 少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一 种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码 免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表 达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不 等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了 极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在 该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一 个表达载体。 在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结 合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻 链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性 分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望 的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.， Methods in Enzymology 121：210(1986)。 依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养 物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域 CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链 用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基 酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧 链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如 同二聚体提高异二聚体产量的机制。 双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种 抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议 用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治 疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联 方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交 联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。 文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化 学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)记载了通过 蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇 络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的 形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后 将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩 尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性 抗体可用作酶的选择性固定化试剂。 最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶 联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了 完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种 Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双 特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细 胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。 还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种 技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol. 148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合 与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体， 然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。 Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗 体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相 连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两 个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个 片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了 通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见 Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。 设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.， J.Immunol.147：60(1991)。 多价抗体 多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的 内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的 核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体) 的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多 抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在 这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。 本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原 结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述 多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc 是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽 链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区 链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域 多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文 设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。 抗体变体 在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可 能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体 是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包 括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、 插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。 可在制备序列时将氨基酸改变引入抗体氨基酸序列。 可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨 酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所 述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天 冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选 丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在 或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示出功能敏感性的氨基酸 位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变 本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密 码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的 活性。 氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基 至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。 末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的 抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如用于ADEPT) 或延长抗体血清半衰期的多肽融合。 抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变包括删除 在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个 或多个糖基化位点。 多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合 物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰 胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促 附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这些三肽序列任一的存在产 生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖 或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5- 羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。 向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个 上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通 过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行 (用于O-连接的糖基化位点)。 若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申 请US 2003/0157108(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构 附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利第6,602,684号 (Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖 胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区 的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc 区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)。关于 具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana et al.)。 本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构 缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一 步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处 的替代(Eu残基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出 版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng. 87：614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺 陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)； 美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1， Adams et al.，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因， FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614 (2004))。 另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基 酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也 设想了FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生 物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文 参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。 表1   原始残基 例示替代 优选替代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln Asp(D) Glu；Asn Glu Cys(C) Ser；Ala Ser Gln(Q) Asn；Glu Asn   Glu(E) Asp；Gln Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val；Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu 对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差 异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或 螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。 根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组： (1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性的：Asp、Glu； (4)碱性的：His、Lys、Arg； (5)影响链取向的残基：Gly、Pro； (6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。 非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。 一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个 高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本 抗体将具有改良的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法涉及 使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个 位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示 在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。 然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和 力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定 对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物 的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及 邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变 体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具 有优良特性的抗体用于进一步的开发。 编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来 制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体 的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸 介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。 可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修 饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰 链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如替代)的人Fc区序列(如人IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4Fc区)。 依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明方法中 所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。 与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相 同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞 毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642 中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter，Nature 322： 738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；及WO94/29351。 WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合 提高或降低的抗体变体。在此明确收入这些专利出版物的内容作为参考。还 可参见Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。半衰期延长且对新 生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG转移给胎儿)(Guyer et al.，J.Immunol. 117：587(1976)及Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))的结合改良的抗体记载 于US2005/0014934A1(Hinton et al.)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc 区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升 高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1，WO99/51642。在此明 确收入这些专利出版物的内容作为参考。还可参见Idusogie et al.J.Immunol. 164：4178-4184(2000)。 抗体衍生物 可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非 蛋白质性质部分。优选的是，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶 性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚 物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊 环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚 物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷 /环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由 于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是 任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可 以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分 子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型， 包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条 件下的治疗等。 筛选具有所需性质的抗体 本发明的抗体可以用本领域已知的各种测定法对其物理/化学性质和生 物功能进行表征。在一些实施方式中，抗体表征为如下任意一种或者多种特 征:结合OX40L，减弱或者阻断OX40L活化，减弱或者阻断OX40L下游分子 信号转导，减弱或者阻断OX40受体活化，减弱或者阻断OX40受体下游分子 信号转导，减弱或者阻断OX40结合OX40L和/或OX40L多聚化，和/或对免疫 病症(例如，哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，多发性硬化，GVHF或者系 统性红斑狼疮)的治疗和/或预防；和/或对与OX40L表达和/或活性(例如增 加的OX40L表达和/或活性)相关的病症的治疗和/或预防。 纯化的抗体还可以通过一系列测定法进行表征，包括但不限于，N端测 序，氨基酸测定，非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)，质谱测定，离子 交换层析和木瓜蛋白酶消化。 在本发明的某些实施方式中，对此处制备的抗体进行它们的生物学活性 测定。在一些实施方式中，对本发明抗体检验它们的抗原结合活性。本领域 已知的并且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于利用以下技 术的任意直接或者竞争性的结合测定法：Western印迹，放射免疫测定，ELISA (酶联免疫吸附法)，“夹心法”免疫测定，免测沉淀测定，荧光免疫测定和 蛋白A免疫测定。在下面的实施例部分提供说明性的抗原结合测定法。 在一些实施方式中，本发明提供抗OX40L单克隆抗体，所述抗OX40L 单克隆抗体与抗体8E12和/或13G5抗体竞争结合OX40L。这种竞争抗体包括 识别OX40L表位的抗体，所述OX40L表位与抗体8E12和/或13G5识别的 OX40L表位相同或者重叠。这种竞争抗体可以通过对抗OX40L杂交瘤上清筛 选与标记的8E12和/或13G5抗体竞争结合固定的OX40L来获得。与包含无关 (或者无)抗体的对照结合混合物中检测到的结合、标记抗体的量相比，包 含竞争抗体的杂交瘤上清将降低受试竞争结合混合物中结合、标记抗体的 量。此处描述的任意竞争结合测定法均适用于上面的步骤。 利用任意方便的方法通过筛选具有所需性质的抗OX40L杂交瘤克隆可 以获得具有此处所述性质的本发明抗OX40L抗体。例如，如果阻断或者不阻 断OX40受体与OX40L结合的抗OX40L单克隆抗体是需要的，那么可以在结 合竞争测定法中检测候选抗体，所述检测例如竞争性结合ELISA，其中板上 的孔用OX40L包被，在包被的板上放置包含过量OX40受体的抗体溶液；所 述检测例如酶法检测结合的抗体，例如将结合的抗体与HRP偶联抗Ig抗体或 者生物素化的抗Ig抗体接触并进行HRP显色反应，例如将板与链霉亲和素 -HRP和/或过氧化氢反应，利用ELISA板读数器在490nm通过分光光度法检 测HRP显色反应。 如果需要抑制OX40L活化的抗OX40L抗体，可以通过检测OX40L途径 信号转导或者OX40途径信号转导的测定法检测，例如NFκB信号转导测定 法。这种测定法是本领域已知的。 确定抗OX40L抗体抑制能力的其它功能试验是本领域已知的，其中一些 在此处举例说明。 在一些实施方式中，本发明预期具有一些但不是全部效应器功能已有变 化的抗体，这使其成为许多应用的所需候选物，其中抗体在体内的半衰期很 重要但某些效应器功能(例如补体和ADCC)是无用或者有害的。在某些实 施方式中，测量制备免疫球蛋白的Fc活性以确保只有所需性质被保留。可以 进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。 例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺失FcγR结合(因此可 能缺失ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。调节介导ADCC的主要细胞，NK 细胞，它们只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在 Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)第464页的表3概述了 造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或者5,821,337描述了体外测定感 兴趣分子的ADCC活性的实例。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单 个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选的，或者此外，可以在体 内测定感兴趣的分子的ADCC活性，例如，在例如Clynes等人PNAS(USA) 95：652-656(1998)公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定以证实抗体不 能结合C1q从而缺失CDC活性。为了检测补体激活，可以进行CDC测定，例 如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)的描述。也可以 利用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定。 在一些实施方式中，本发明提供具有增强效应器功能和/或延长半衰期 的改变的抗体。 载体、宿主细胞和重组方法 为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载 体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易地分离编码 抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的 寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主 细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。应 当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE 恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。 a.使用原核宿主细胞生成抗体： i.载体构建 可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。 可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者， 可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序 列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发 明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决 于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功 能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿 主细胞的相容性，每种载体含有不同的构件。载体构件通常包括但不限于复 制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源 核酸插入片段、和转录终止序列。 一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容 物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中 提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322 转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基 因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生 物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源 蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特 定抗体的pBR322衍生物的实例。 另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用 作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用 于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。 本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一 种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺 反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动 子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控 制的顺反子的升高水平转录的启动子。 众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切 下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选 择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和 许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中， 使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基 因的更高转录和更高产量。 适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动 子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而， 在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是 合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何 所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作 连接(Siebenlist et al.，Cell 20：269(1980))。 在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽 穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或 者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列 应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不 识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例 如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠 毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一 个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列 或其变体。 在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中 发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋 白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些 宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从 而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Pluckthun，Gene 159： 203(1995))。 适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真 细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例 包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌(大肠杆菌，E.coli))、芽孢 杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、 假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙 门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克 雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根 瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。 在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆 菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann， Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学 会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基 因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR 的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌 294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠 杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本 领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如 Bass et al.，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的 可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、 pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、 或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋 白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。 ii.抗体生成 用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩 增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。 转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色 体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标 准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌 细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。 在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本 发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB 培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建 而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用 于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。 除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补 充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合 氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、 半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。 在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温 度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主 要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于 大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。 如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的 条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽 的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。 优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons et al.，J. Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用 多种其它诱导物，正如本领域所知道的。 在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从 中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清 除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或 者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培 养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的 方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定 所表达蛋白质。 在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补 料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量， 优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养 分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超 过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。 在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如 OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。 根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描 述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时， 但是可使用更长或更短的诱导时间。 为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了 改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb 蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一 种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经 证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解 度。Chen et al.，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国 专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann and Pluckthun，J. Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm and Pluckthun，J.Biol.Chem.275： 17106-17113(2000)；Arie et al.，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。 为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋 白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如， 可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如 蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI 及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.，(1998) 见上文；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192； Hara et al.，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。 在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过 过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。 iii.抗体纯化 可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程 的例示:免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或 阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、 和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。 在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫 亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细 胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.，J.Immunol.Meth. 62：1-13(1983))。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子， 更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包 被，试图防止污染物的非特异粘附。 作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白 A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固 相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。 b.使用真核宿主细胞生成抗体： 载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一 种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。 (i)信号序列构件 在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包 含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工 (即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺 乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。 将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。 (ii)复制起点 通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常 可能只因包含早期启动子才使用。 (iii)选择基因构件 表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编 码如下蛋白质:(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、 甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获 得的关键营养物。 选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功 转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显 性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。 适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗 体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵 长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。 例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞 争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在 采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。 或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那 霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR 蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化 或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利 4,965,199。 (iv)启动子构件 表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽 核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具 有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的 转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以 是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码 序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表 达载体中。 在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤 病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、 巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、 来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来 自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的 话。 方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子， 该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得 人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤 病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载 了该系统的一种修改或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动 子。 (v)增强子元件构件 常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明 抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、 清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核 细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、 巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病 毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18 (1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是 优选位于启动子的5′位点。 (vi)转录终止构件 在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA 所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端 和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成 聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺 苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。 (vii)宿主细胞的选择和转化 适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真 核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁 殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾 CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚 克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞 (BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather， Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿 猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A， ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2， HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather et al.， Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞 瘤(hepatoma)系(Hep G2)。 为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱 导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培 养基中进行培养。 (viii)宿主细胞的培养 可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基 诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿 主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基： Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255 (1980)；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需 要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、 盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如 腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通 常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可 以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如 温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是 显然的。 (ix)抗体的纯化 在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。 如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片， 或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用 商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来 自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如 PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。 可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技 术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适 宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A 可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth. 62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可 使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能 获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可 使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据 待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙 醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子 或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE 和硫酸铵沉淀。 在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低 pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如 约0-0.25M盐)进行。 免疫偶联物 本发明还提供了包含偶联有细胞毒剂的本文所述任何抗OX40L抗体的 免疫偶联物(可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸 如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶 活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。 抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试 剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos， Anticancer Research 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv. Drg.Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利4,975,278)能将药物部分靶向投 递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂 可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平 (Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506 页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体 皆有报道可用于这些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.21： 183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔 比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland et al.，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉 毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin) (Mandler et al.，Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)； Mandler et al.，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利 车霉素(Lode et al.，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.53： 3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶 抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大 的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。 (ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶 性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与通过硫脲接 头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联 物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman et al.， Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63 (2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具 有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数 患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而 构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美国专利4970198；5079233；5585089； 5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumab mertansine (Immunogen Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱 药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg 的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704 (Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜 抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体 -药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀 (dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin (MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶 性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina et al.，Nature Biotechnology 21(7)： 778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。 本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶 活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素 A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、 相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、 油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制 物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis) 抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、 酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参 见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放 射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂 的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基 -3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸 己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸 如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生 物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸 酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二；硝基苯)的双功能衍生物。例 如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒 素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA) 是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。 本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素 (calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类 (dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具 有毒素活性的片段的偶联物。 i.美登素和美登木素生物碱类 在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱 分子的本发明抗体(全长或片段)。 美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂 抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美 国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美 登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美 登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608； 4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946； 4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219； 4,450,254；4,362,663；及4,371,533。 美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模 块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备； (ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳 定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。 例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备和 治疗用途:美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，明确 将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93： 8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的 称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结 肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。 Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经 二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌 基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系 SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细 胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药 物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素 生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性 细胞毒性。 抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学 连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例 如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体 分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显 示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的 毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域 是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利 5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素 生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它 位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。 本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包 括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1；Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；2004年10月9日提交的美国专利中请No. 10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构 件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国 专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫 醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基 团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述 和例示了别的连接基团。 可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联 物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基 -4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸 酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨 基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二 胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸 如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯) 的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫 代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀 酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。 根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例 如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有 羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具 有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的 C-3位置形成键连接。 ii.Auristatin和多拉司他汀 在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉 司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No. 5,635,483；5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力 学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或 auristatin药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着 于抗体(WO 02/088172)。 例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块 DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，US流水号No.10/983,340，2004年11月5日提交，明确将其公开内容 完整收入本文作为参考。 典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段 之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成 法来制备(参见E. and K.Lübke，The Peptides，volume 1，pp 76-136， 1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方 法来制备:US 5,635,483；US 5,780,588；Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc. 111：5463-5465；Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit， GR.，et al.Synthesis，1996，719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784； “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，美国流水 号No.10/983,340，2004年11月5日提交，将其完整收入本文作为参考(披露了 例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和 方法)。 iii.加利车霉素 在其它说是反拿中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子 的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA 断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586； 5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国 Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、 N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342 (1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国 Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它 是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质 膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细 胞毒效果。 iv.其它细胞毒剂 可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、 长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的 统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国 专利5,877,296)。 可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性 片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋 白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α- 帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美 洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草 (sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端 孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。 本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或 DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。 为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素 可用于生成放射偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、 Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射 性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁 共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、 氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。 可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽， 或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适 氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、 Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。 《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989) 详细记载了其它方法。 可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如 N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马 来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸 如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、 醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双 重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯 2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功 能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻 毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙 酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见 WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例 如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或 含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利 5,208,020)。 本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化 (如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、 GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、 SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、 sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基 砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。 v.抗体-药物偶联物的制备 在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或 多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用 本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式 I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L， 随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂 反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC 的别的方法。 Ab-(L-D)p             I 接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰 亚胺己酰基(＂MC＂)、马来酰亚胺丙酰基(＂MP＂)、缬氨酸-瓜氨酸(＂val-cit＂)、 丙氨酸-苯丙氨酸(＂ala-phe＂)、对氨基苄氧羰基(＂PAB＂)、4-(2-吡啶基硫代)戊 酸N-琥珀酰亚氨基酯(＂SPP＂)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰 亚氨基酯(＂SMCC′)、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(＂SIAB＂)。 本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”，美国流水号No.10/983,340， 2004年11月5日提交，将其完整内容收入本文作为参考。 在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件 包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或 val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括:甘氨酸-缬氨酸 -瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接 头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天 然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶 (例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶促切 割的选择性方面进行设计和优化。 抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨 酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨 基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共 价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、 和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮 类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨 酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀 合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经 由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而 将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多 个半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突 变型抗体)而将反应性硫醇基导入抗体(或其片段)。 还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头 试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧 化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或 酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂 还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部 分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团， 它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另 一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠 反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh，Bioconjugate Chem. 3：138-146(1992)；US 5,362,852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。 同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、 肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上 的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS 酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如 卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。 或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合 蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或 是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。 在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而 用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由 循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联 的“配体”(如亲合素)。 药用配制剂 包含本发明抗体的治疗用配制剂可通过将具有期望纯度的抗体与任选 的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000))混合，以水溶液、冻干或其它干燥剂 型的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓 度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它 有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基 二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇； 对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚； 环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质， 诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单 糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA； 糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属 复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、 PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。 本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化 合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对 于预定目的有效的量组合存在。 活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊 中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、 在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和 纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000)。 用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过 滤来实现。 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明免疫球 蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜 或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基 丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与L-谷 氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚 物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可 注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸 等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较 短。当封装的免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的 潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根 据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫- 二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液 冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。 用途 本发明的抗体可用于，例如，体外(in vitro)、离体(ex vivo)和体内(in vivo) 治疗方法。 一方面，本发明提供治疗或者预防免疫病症的方法，该方法包括给需要 这种治疗的患者施用有效量的抗OX40L抗体。在一些实施方式中，所述病症 是免疫病症。在一些实施方式中，所述病症是自身免疫病症。在一些实施方 式中，所述病症是哮喘，特应性皮炎，过敏性鼻炎，炎症性肠病，多发性硬 化，GVHD和/或系统性红斑狼疮。在一些实施方式中，所述病症是与疾病 相关的病毒、细菌或者其它感染原所致的病症。参见US2005/0069548 A1。 此外，本发明的至少一些抗体能够结合其它种属的抗原。因此，可使用 本发明的抗体结合特异抗原的活性，例如，在包含抗原的细胞培养物中，在 具有与本发明抗体交叉反应的抗原的人类受试者或者其它哺乳动物中(例如 黑猩猩，狒狒，狨，短尾猴和恒河猴，猪或者小鼠)结合抗原。在一个实施 方式中，本发明的抗体可用于抑制抗原的活性，通过将抗原与抗体接触以致 抗原活性被抑制。优选的，所述抗原是人蛋白分子。 在一个实施方式中，可以在结合患者体内抗原的方法中使用本发明的抗 体，包括给受试者施用本发明的抗体以致受试者体内的抗原被结合，所述受 试者患有与增加的抗原表达和/或活性有关的病症。优选的，抗原是人蛋白分 子，受试者是人受试者。此外，受试者可以是表达与本发明的抗体结合的抗 原的哺乳动物。此外受试者可以是已经导入抗原的哺乳动物(例如，通过抗 原给药或者通过抗原转基因表达)。本发明的抗体可以给药人类受试者用于 治疗目的。此外，本发明的抗体可以给药非人哺乳动物用于兽医目的或者作 为人类疾病的动物模型，所述非人哺乳动物(例如，灵长类动物，猪或者小 鼠)表达与免疫球蛋白交叉反应的抗原。对于后者，这种动物模型可用于评 价本发明抗体的治疗效果(例如，剂量和给药时程的试验)。 本发明的抗体可用于治疗、抑制、延缓进展、预防/延缓复发、改善或 者预防一种或者多种与抗原分子的表达和/或活性相关的疾病、紊乱或者状 态。 在某些实施方式中，给患者施用免疫偶联物，所述免疫偶联物包括与一 种或者多种细胞毒性剂偶联的抗体。在一些实施方式中，免疫偶联物和/或其 结合的抗原被细胞内化，导致免疫偶联物在杀伤其结合的靶细胞方向治疗效 力增强。在一个实施方式中，细胞毒性剂靶向或者干扰靶细胞中的核酸。在 一个实施方式中，细胞毒性剂靶向或者干扰微管聚合。这种细胞毒性剂的实 例包括此处记录的任意一种化疗剂(例如maytansinoid，auristatin，dolastatin 或者calicheamicin)，放射性同位素，或者核糖核酸酶或者DNA核酸内切酶。 在疗法中本发明的抗体可以单独使用与其它组合物组合使用。例如，本 发明的抗体可以与另外的抗体、类固醇(例如可吸入的、全身性或者皮肤用 固醇)、化疗剂(包括化疗剂的混合物)、其它细胞毒性剂、抗血管生成剂、 细胞因子和/或生长抑制剂共同给药。上面提及的这种组合疗法包括组合给药 (其中两种或更多药剂被包括在相同或者分离的制剂中)和分别给药，在这 种情况下，本发明抗体的给药可以发生在辅助疗法给药之前和\或之后。与抗 EphB4抗体共同给药的治疗剂的有效量取决于医师或者兽医的判断。完成剂 量给药和调整以实现对待治疗病症的最大控制。此外剂量取决于使用的治疗 剂类型和待治疗的特定患者状况。在某些实施方式中，抑制剂的组合增强单 一抑制剂的效果。术语“增强”是指治疗剂在其常用或者批准剂量时效果的提 高。 本发明抗体(和辅助治疗剂)通过任意合适的方法给药，包括肠胃外的， 皮下的，腹膜内的，肺内的和鼻内的，和，如果需要局部疗法，局部给药。 肠胃外输注包括肌内的，静脉内的，动脉内的，腹膜内的或者皮下的给药。 此外，通过脉冲输注适当给药抗体，尤其是逐渐降低剂量的抗体。可以通过 任意合适的途径给药，例如通过注射，例如静脉内或者皮下注射，这部分取 决于是短暂给药还是长期给药。 以符合良好医疗实践的方式配方(formulated)、配制(dosed)和给药本发明 的抗体组合物。该情况下考虑的因素包括待治疗的特定病症，待治疗的特定 哺乳动物，个体患者的临床病症，病症起因，药剂输送位点，给药方法，给 药时间表，和执业医生已知的其它因素。抗体没有必要，但是可选地与一种 或者多种目前用于预防或者治疗所述病症的药剂一起配制。这类其它药剂的 有效量取决于制剂中存在的本发明抗体的量、病症或者治疗的类型和上面讨 论的其它因素。这些通常使用与上文所用相同的剂量和给药途经，或者大约 从1到99％的在此之前使用的剂量。 为了疾病的预防或者治疗，本发明抗体的合适剂量(当单独使用或者与 其它药剂联合使用时)取决于待治疗疾病的类型，抗体类型，疾病的严重程 度和病程，给药抗体是用于预防还是治疗目的，先前的疗法，患者临床史和 对抗体的应答，和主治医师的判断。将抗体一次性或者在一系列治疗中适当 地给药患者。根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到15mg/kg(例如 0.1mg/kg-10mg/kg)抗体是给药患者的初始候选剂量，例如，通过一次或者多 次分别给药，或者通过连续的输注。一种典型的每日剂量可以从大约1μg/kg 到100mg/kg或者更多，取决于如上所述的因素。为了在数天或者更长时间 内重复给药，根据病症，维持治疗直到发生所期望的症状抑制。抗体的示范 性剂量从大约0.05mg/kg到大约10mg/kg。因此，可以给药患者大约0.5mg/kg， 2.0mg/kg，4.0mg/kg或者10mg/kg(或者其任意组合)的一种或者多种剂量。 这种剂量可以间歇给药，例如每隔一周或者每隔三周(例如这样的话患者收 到大约2到大约20，例如大约6个剂量的抗体)。可以给药更高的起始负载剂 量(initial loading dose)，继之以一种或者多种更低的剂量。示范性的给药方 式包括给药大约4mg/kg的起始负载剂量，继之以大约2mg/kg抗体的周维持 剂量。但是，也可以使用其它给药剂量方案。可以方便的通过常规技术和测 定法监控这类疗法的进程。 本发明的抗OX40L抗体可用于特定细胞或者组织中检测OX40L表达的 测定法(例如诊断或者预测测定法)，其中抗体按如下所述进行标记和/或固 定在不溶基质上。 另一方面，本发明提供用于OX40L检测的方法，该方法包括检测样品中 的OX40L-抗OX40L抗体复合物。本文使用的术语“检测”包括参考对照或者 不参考对照的定性和/或定量检测(测量水平)。 另一方面，本发明提供诊断与OX40L表达和/或活性相关的病症的方法， 该方法包括检测生物样品中的OX40L-抗OX40L抗体复合物，所述生物样品 来自患有或者怀疑患有所述病症的患者。在一些实施方式中，OX40L表达是 增加的表达或者异常(不需要)的表达。 另一方面，本发明提供任意一种本文描述的抗OX40L抗体，其中抗 OX40L抗体包括可检测的标记。 另一方面，本发明提供本文描述的任意一种抗OX40L抗体和OX40L的复 合物。在一些实施方式中，所述复合物是体内或者体外的。在一些实施方式 中，所述复合物包括癌细胞。在一些实施方式中，抗OX40L抗体被可检测的 标记。 抗OX40L抗体可用于大量公知检测分析法中任意一种的OX40L检测。例 如，通过从目标来源获得样品用于对生物样品进行OX40L的测定，将样品与 抗OX40L抗体混合以允许抗体与混合物中存在的任意OX40L形成抗体 /OX40L复合物，检测混合物中存在的任意抗体/OX40L复合物。可以通过本 领域已知的适于特定样品的方法制备生物样品。根据使用的测定类型选择混 合样品与抗体的方法和检测抗体/OX40L复合物的方法。这类测定法包括免 疫组织化学，竞争性和夹心测定法，和空间位阻测定法。 OX40L分析方法均使用一种或者多种下列试剂：标记的OX40L类似物， 固定的OX40L类似物，标记的抗OX40L抗体，固定的抗OX40L抗体和空间偶 联物。标记的试剂还被称为“显迹物”。 使用的标记物是不干扰OX40L和抗OX40L抗体结合的任意可检测官能 团。已知许多标记物可用于免疫测定法，实例包括可以直接检测的基团 (moiety)，例如荧光染料、化学发光和放射性标记物以及基团，例如酶，它 们必须反应或者衍生以便能够被检测。这种标记物的实例包括： 使用的标记物是不干扰OX40L和抗OX40L抗体结合的任意可检测官能 团。许多标记物已知可用于免疫测定法，实例包括可以直接检测的基团，例 如荧光染料、化学发光和放射性标记物以及基团，例如酶，它们必须反应或 者衍生以便能够被检测。这种标记物的实例包括放射性同位素32p，14C，125I， 3H和131I，荧光团例如稀土螯合物或者荧光素和其衍生物，若丹明和其衍生 物，丹酰，伞形酮，荧光素酶，例如，荧火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美 国专利4,737,456)，荧光素，2，3-dihydrophthalazinediones，辣根过氧化物酶 (HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶， 例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶 例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联使用过氧化氢以氧化染料前体(例如HRP) 的酶、乳过氧化物酶或者微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、 噬菌体标记物、稳定自由基，等等偶联。 已经有将这些标记物共价结合到蛋白或者多肽的常规方法。例如，偶联 剂例如二醛，碳化二亚胺，双马来酰亚胺，双亚氨酸乙酯，双偶氮联苯胺和 类似物可用于标记具有上述荧光、化学发光和酶标记物的抗体。参见，例如， 美国专利3,940,475(荧光测定法)和3,645,090(酶)；Hunter等人，Nature，144： 945(1962)；David等人，Biochemistry，13：1014-1021(1974)；Pain等人，J. Immunol.Methods，40：219-230(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.， 30：407-412(1982)。此处优选的标记物是酶例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸 酶。包括酶的这种标记物与抗体的偶联对熟悉免疫测定技术的普通技术人员 来说是一种标准操作步骤。参见，例如，O′Sullivan等人，＂Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay，＂ in Methods in Enzymology，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73 (Academic Press，New York，New York，1981)，147-166页。 某些测定法需要试剂的固定。固定需要将抗OX40L抗体同仍然在溶液中 游离的任意OX40L分离。在测定步骤前通常伴随使抗OX40L抗体或者OX40L 类似物不溶解，通过吸附到不溶于水的基质或者表面(Bennich等人，U.S. 3,720,760)，通过共价偶联(例如，利用戊二醛交联)，或者之后通过使OX40L 抗体或者OX40类似物不溶解(例如，通过免测沉淀法)。 可以利用免疫组织化学和染色实验步骤检测样品中蛋白的表达。组织切 片的免疫组织化学染色已被证明是一种测定或者检测样品中蛋白存在的可 靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体探测并在原位观察细胞抗原， 这通常通过生色或者荧光方法进行。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物 (通常是人类患者)的组织或者细胞样品。可以通过本领域已知的各种步骤 获得样品，包括但不限于手术切割、抽吸或者活组织切片。组织可以是新鲜 或者冷冻的。在一个实施方式中，样品被固定和埋入石蜡或者类似物中。可 以通过常规方法固定(即保存)组织样品。本领域普通技术人员清楚固定剂 的选择由样品是用于组织染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术 人员还清楚固定时长取决于组织样品的大小和使用的固定剂。 IHC可以与其它技术例如形态学染色和/或荧光原位杂交一起进行。现有 两种常用的IHC方法；直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接检测抗 体与靶抗原(例如，OX40L)的结合。这种直接测定法使用标记的试剂，例 如荧光标签或者酶标记的第一抗体，其不需要进一步的抗体相互作用就能观 察。在典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合抗原，然后标记的第二 抗体结合第一抗体。当第二抗体与酶标记物偶联时，添加生色或者荧光底物 以观察抗原。因为若干种第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应而发生 信号放大。 用于免疫组织化学的第一和/或第二抗体通常用可检测的基团标记。现 有的许多标记物通常可以分成下列类型: 除了上述讨论到的样品制备步骤外，可能还需要在IHC之前、期间或者 之后对组织切片进行处理，例如，表位恢复方法，例如在柠檬酸缓冲液中对 组织样品进行加热(参见，例如，Leong等人Appl.Immunohistochem.4(3)：201 (1996))。 在任选封闭步骤后，组织切片在合适条件下接触第一抗体足够时间段以 便第一抗体与组织样品中的靶蛋白抗原结合。实现这些的合适条件可以通过 常规试验方法确定。抗体与样品的结合程度通过使用上述讨论到的任意一种 可检测标记物来确定。优选的，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生 色底物例如3，3′-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的酶标记物被偶联到 特异结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是兔多克隆抗体，第二抗体是山羊 抗兔抗体)。 如此制备的标本被固定和盖片。然后进行载玻片鉴定，例如利用显微镜， 可以使用本领域常规使用的染色强度标准。 其它测定法，称为竞争性或者夹心测定法，已经被明确建立并被广泛用 于商业诊断工业。 竞争分析法依赖于显迹物OX40L类似物与待测样品OX40L竞争有限量 的抗OX40L抗体抗原结合位点的能力。竞争前后抗OX40L抗体通常是不溶解 的，然后将结合抗OX40L抗体的显迹物和OX40L与未结合的显迹物和OX40L 分离。通过轻轻倒出(其中结合伴侣是预先不溶解的)或者通过离心(其中 结合伴侣在竞争反应后沉淀)实现这种分离。待测样品OX40L的量与结合的 显迹物的量成反比，所述结合显迹物的量通过标记物质的量测定。绘制 OX40L已知量的剂量反应曲线，与试验结果进行比较以定量确定待测样品中 存在的OX40L的量。当使用酶作为可检测标记物时，这些测定法被称为 ELISA系统。 另一种竞争分析法，称为“均相”测定法，不需要相分离。此处，制备并 使用酶与OX40L的偶联物，这样的话当抗OX40L抗体结合OX40L时，抗 OX40L抗体的存在改变酶活性。在这种情况下，OX40L或者其免疫活性片段 与双功能有机桥偶联到酶例如过氧化物酶上。选择偶联物以与抗OX40L抗体 一起使用以便抗OX40L抗体的结合抑制或者增强标记物的酶活性。该方法本 身被广泛使用，称作EMIT。 空间偶联物用于均相测定法的位阻方法。通过将低分子量半抗原共价连 接到小OX40L片段合成这些偶联物，以便针对半抗原的抗体基本上不会与抗 OX40L抗体同时结合偶联物。在此测定步骤下待测样品中存在的OX40L将结 合抗OX40L抗体，从而允许抗-半抗原结合所述偶联物，导致偶联物的半抗 原特性的变化，例如，当半抗原是荧光基团时荧光的变化。 夹心测定法尤其可用于OX40L或者抗OX40L抗体的测定。在顺次夹心测 定法(sequential sandwich assays)中固定的抗OX40L抗体用于吸附待测样品 OX40L，通过洗涤去除待测样品，结合的OX40L用于吸附标记的第二抗 OX40L抗体，然后从残余显迹物中分离结合的材料。结合显迹物的量与待测 样品OX40L成正比。“平行”夹心测定法中在添加标记的抗OX40L前不分离待 测样品。使用抗OX40L单克隆抗体作为一种抗体和多克隆抗OX40L抗体作为 另一种抗体的顺次夹心测定法可用于检测样品的OX40L。 上文仅仅是OX40L的示范性检测分析法。现在或者此后发展的使用抗 OX40L抗体测定OX40L的其它方法均包括在本发明范围内，包括此处描述的 生物测定法。 制品 在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文 所述紊乱病症的物质的制品。该制品包括容器和贴在所述容器上或与其相连 的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用 各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时 有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器 可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中 的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗 选择的疾患，诸如哮喘。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器， 其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器。本发 明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特 定疾患例如哮喘的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器， 其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐 水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需 的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。 下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般 描述，可实施各种其它实施方案。 实施例 实施例1：抗OX40L小鼠单克隆抗体8E12和13G5的制备 按如下所述制备针对人OX40L胞外序列的抗体。5只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，DE)用溶于Ribi佐剂(Ribi Immunochem Research，Inc.，Hamilton，MO)的重组人OX40L-标记多肽(融合到标记肽的人 OX40配体胞外结构域，由CHO细胞表达，Genentech，Inc.，South San Francisco， CA)进行超免疫(hyper immunize)。来自显示高抗OX40L抗体滴度的小鼠的B 细胞与小鼠骨髓瘤细胞(pul.Anan.22.4，Genentech，Inc.，South San Francisco， CA)融合。数天后，收集上清，通过直接酶联免疫吸附测定(ELISA)对抗 体产生进行筛选。利用Protein A亲和层析(Pharmacia快速蛋白液相层析， Pharmacia，Uppsala，Sweden)纯化来自阳性克隆生长-条件培养基的IgG。纯化 的抗体制品进行无菌过滤(0.2-μm孔径大小；Nalgene，Rochester NY)，4℃保存 于磷酸盐缓冲液(PBS)中。 利用ELISA阳性克隆的生长-条件培养基进行基于流式细胞术的测定 法，筛选与重组OX40R-Fc(与CHO细胞表达的IgG1 Fc片段融合的人OX40 受体，Genentech，Inc.)竞争结合CHO细胞上表达的人OX40L的单克隆抗体。 CHO-OX40L细胞与OX40R-Fc预孵育，然后添加生长-条件培养基。孵育后， 细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，然后用藻红蛋白偶联的抗小鼠IgG染色以检测结 合的小鼠抗人OX40L单克隆抗体的量。测定平均荧光指数(MFI)。在这些 测定中称为8E12和13G5的单克隆抗体(Mabs)表现良好。 利用标准方法从产生8E12和13G5抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA。使 用下列重链和轻链的简并引物通过RT-PCR扩增轻链可变区(VL)和重链可变 区(VH)。正向引物对VL和VH区的N端氨基酸序列特异。将LC和HC反向引物 分别设计成分别与轻链恒定区(CL)和重链恒定区结构域1(CH1)退火，它们在 种属间是高度保守的。扩增的VL和VH区被克隆入哺乳动物表达载体，利用 常规测序方法测定插入的多核苷酸序列。图1显示8E12VL和VH氨基酸序列。 图3显示13G5VL和VH氨基酸序列。 实施例2：Mab 8E12和13G5结合OX40L蛋白的ELISA分析 如下所述进行竞争性ELISA分析以检测溶液中抗OX40L Mabs 8E12和 13G5与OX40L的结合，并检测与细胞表面表达的OX40L结合。在一些实验 中，在4℃maxiSorp 96孔微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)用溶于50mM 碳酸盐缓冲液，pH 9.6的2μg/ml抗FlagM2抗体(Sigma)包被过夜。所述的 板用包含0.05％聚山梨酸酯20的PBS洗涤，用溶于PBS的0.5％牛血清白蛋白、 10ppm Proclin 300(Supelco，Bellefonte，PA)在室温下封闭1小时。洗涤板，并 添加0.5μg/ml人OX40L ECD-Flag多肽。孵育1小时后，洗涤板。添加人 OX40-IgG-bio和用PBS系列稀释的抗体的混合物，所述PBS包含0.5％牛血清 白蛋白，0.05％聚山梨酸酯20，10ppm Proclin 300。将该板在室温下孵育2小 时，并洗涤。通过添加链霉亲和素-HRP(Amdex，Copenhagen，Denmark) 继之以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratones， Gaithersburgg，MD)作为底物以检测结合的人OX40-IgG-bio。使该板显色， 通过添加1M正磷酸终止反应。利用Titertek stacker读数器(ICN，Costa Mesa， CA)在450nm读取吸光度。利用4参数回归曲线拟合程序(KaleidaGraph， Synergy software，Reading，PA)拟合滴定曲线。抗OX40L Mabs 8E12和13G5与 人OX40L结合的近似EC50分别为1.4nM和1.1nM。在一些实验中，与上述类 似进行测定，除了ELISA板用0.5μg/ml人OX40-IgG包被，人OX40-标记 (OX40-Flag)和系列稀释的抗体的混合物在板上孵育，使用抗-Flag-bio抗体继 之以链霉亲和素-HRP来检测结合的人OX40-标记。抗OX40L Mabs 8E12和 13G5与人OX40L结合的近似EC50分别为1.9nM和0.46nM。 在其它实验中，37℃潮湿的5％CO2条件下在50：50 F12/DMEM培养基中 培养表达全长人OX40L的CHO细胞，所述培养基添加了2mM L-谷氨酰胺， 100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素(补给性培养基)，和5％ FBS(Gibco BRL Life Technologies，Gaithersburg，MD)(生长培养基)。利用Accutase(ICN) 从培养板分离细胞，添加到96孔微孔板，300,000个细胞/孔。向板中添加溶 于生长培养基的人OX40-IgG和系列稀释的抗体的混合物。在冰上孵育1小时 后，通过离心板洗涤细胞，去除上清。利用抗-Fc-HRP检测结合的人 OX40-IgG。对于8E12和13G5计算的EC50分别是20和130nM。在一些实验中， 使用人OX40-IgG-bio替代人OX40-IgG。利用链霉亲和素-HRP检测结合的人 OX40-IgG-bio。按如上所述进行板的显色和读数。Mab 8E12和13G5与人 OX40L结合的近似EC50分别为大约11nM和60nM。 这些分析证明Mab 8E12和13G5结合溶液中的人OX40L和CHO细胞上表 达的人OX40L。 为了确定Mab 8E12和13G5是否结合小鼠OX40L，ELISA板用小鼠 OX40L包被。添加系列稀释的8E12或者13G5(0.004-4μg/ml)。使用山羊抗小 鼠Fc-HRP进行检测。未观察到结合。在不同的模式中，ELISA板用8E12或者 13G5包被。添加系列稀释的小鼠OX40L-标记。使用生物素化的抗-标记 (anti-Flag)继之以链霉亲和素-HRP进行检测。未观察到结合。 实施例3：利用表面等离子体共振对Mab 8E12和13G5的分析 在室温下利用Pharmacia  3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden) 通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance)测定小鼠抗OX40L抗体与 人OX40L的结合动力学(Karlsson等人，1994；Morton & Myszka，1998)。通过伯 胺基团将抗-标记抗体(抗-FlagM2，Sigma，St.Louis，MO)固定到传感器芯片 (CM5)。使用高流速以最小化大规模传送的影响。以5μl/分钟注射20μl0.025 MN-羟基琥珀酰亚胺和0.1MN-乙基-N′(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺的混合 物对羧甲基化的传感器芯片表面基质进行活化。溶于10mM醋酸钠，pH 4.5 的7μl 50μg/ml抗-标记以5μl/分钟注入两次。偶联后，通过注入20μl 1M乙 醇胺，pH8.5封闭芯片上未占据的位点。运行缓冲液是包含0.05％聚山梨酸 酯20的PBS。以30μl/分钟注入5μl 4μg/ml OX40L-Flag以便OX40-Flag与芯片 上的抗-Flag结合。对于动力学测定，用运行缓冲液两倍连续稀释的小鼠抗人 OX40抗体8E12(PUR 9333)和13G5(PUR 9306)(6.2-50nM)在30μl/分钟 流速下注入流式细胞2分钟，允许结合的抗OX40L抗体解离20分钟。通过注 入30μl 10mM甘氨酸·HCl(pH 1.5)再生结合表面。具有固定的抗-Flag抗 体但没有OX40L-Flag的流式细胞被用作参照细胞。利用总体拟合通过1:1结 合模型分析数据。同时拟合结合和解离速率常数(BIAevaluation软件)。 对于8E12和13G5 IgG抗体，表观结合速率常数(apparent on-rate constant) 分别是2.6×106和4.8×105(1/Ms)。由于非常缓慢的解离速率(off-rate)动力学， 无法确定解离速率常数(<5×106/s)。对于8E12和13G5 IgG抗体，计算的表观 Kd值分别为<0.019nM和<0.010nM。 实施例4：抗OX40L抗体8E12和13G5识别OX40L上不同的结合决定簇 进行Scatchard结合实验以确定抗OX40L mAb　8E12和13G5是否互相竞 争结合表达人OX40L的CHO细胞上的相似或者重叠表位，并测定所述抗体的 结合亲和力。利用标准乳过氧化物酶(lactoperoxidase)方法进行碘化50μg抗 OX40L小鼠单克隆抗体8E12和13G5。抗体8E12和13G5用培养基缓冲液 (Dubeccos　F12：DMEM，1％牛血清白蛋白，0.05％叠氮钠和25mM Hepes缓冲 液pH7.2)进行1:4连续稀释，起始的初浓度是200nM。在96微孔板中一式 两份进行两组系列稀释(50μL)。各组稀释的每孔添加50μL碘化的8E12或 者13G5(终浓度0.25nM)。将板进行混合，然后将整个混合物转移到96孔组 织培养板，所述组织培养板每孔包含30,000个表达OX40L的CHO细胞，所述 CHO细胞已在前一天接种。覆盖板并在4℃孵育过夜。次日对孔(包含细胞) 进行抽吸，用培养基缓冲液洗涤两次。每孔添加200μL 1N NaOH裂解细胞， 振摇10分钟，然后转移到96孔微型管。在Wallac gamma闪烁计数器中对每管 进行计数。与抗体浓度结合的计数被输入Scatchard分析程序New Ligand以绘 制结合相对结合/游离(plot bound versus bound/free)图，并确定结合亲和力和 受体浓度。对于竞争性实验，收集数据利用Kaleidagraph绘图。利用4参数拟 合绘制曲线。 Mab 8E12与人OX40L结合的Kd为0.92nM。Mab13G5与人OX40L结合 的Kd为1.09nM。8E12和13G5没有互相竞争结合CHO细胞上表达的OX40L， 表明抗OX40L单克隆抗体8E12和13G5识别不同的人OX40L结合决定簇。 实施例5：抗OX40L抗体抑制人OX40L和人OX40的相互作用 进行竞争性结合实验以确定抗OX40L Mab 8E12和13G5是否与碘化的 OX40-Fc(与Fc结构域融合的OX40受体胞外结构域)竞争结合CHO细胞上 表达的OX40L。利用标准乳过氧化物酶方法碘化50μg OX40L-Fc配体。抗体 8E12和13G5用培养基缓冲液(Dubeccos F12：DMEM，1％牛血清白蛋白，0.05％ 叠氮钠和25mM Hepes缓冲液pH7.2)进行1:4连续稀释，起始于初浓度200 nM。在96微孔板中一式两份进行稀释(50μL)。每孔添加50μL碘化的 OX40L-Fc(终浓度0.25nM)，混合，然后将整个混合物转移到96孔组织培养 板，所述组织培养板每孔包含30,000个表达OX40L的CHO细胞，所述CHO细 胞前一天已经接种。覆盖板并在4℃孵育过夜。次日对孔(包含细胞)进行 抽吸，用培养基缓冲液洗涤两次。每孔添加200μL 1N NaOH裂解细胞，振摇 10分钟，然后转移到96孔微型管。在Wallac gamma闪烁计数器中对每管进行 计数。收集数据，利用Kaleidagraph绘图。利用4参数拟合绘制曲线。 图3显示该实验的结果。Mab 8E12(空心三角形)和13G5(实心正方形) 与OX40受体竞争结合CHO细胞上表达的OX40L，表明上述抗体抑制人OX40 受体与人OX40L的结合。 实施例6：在基于细胞的测定法中抗OX40L抗体处理抑制T细胞增殖 进行混合淋巴细胞反应(MLR)测定以确定抗OX40L单克隆抗体对 OX40L-OX40相互作用的阻断是否抑制T细胞增殖。这种基于细胞的实验检 测抗OX40L抗体抑制OX40L信号转导的能力。简单来说，根据制造商的说明 书(Miltenyi Biotec)利用BDCA-4MACS珠子从人血液中分离浆细胞样树突 状细胞(pDC)。细胞以1×106个细胞/ml在包含RPMI/10％胎牛血清/2mM L- 谷氨酰胺的培养基中培养，用2.5μg/ml可溶性人CD40L蛋白(R & D Systems) 和10ng/ml人IL-3蛋白(R & D Systems)刺激3天以便活化pDC。活化的(pDC) 然后用磷酸盐缓冲液/3％胎牛血清洗涤三次，然后与CD45RA+初始T细胞 (naive T cell)共培养，所述CD45RA+初始T细胞是根据制造商的说明书 (Miltenyi Biotec)利用MACS珠子从人血液分离的。在指定试剂存在条件下， 共培养物以1:200的pDC:T细胞比例，在U型底96孔板中以每孔1×105T细胞浓 度培养1周。在最后6小时培养期间细胞接受每孔1uCi甲基-氚化胸腺嘧啶的脉 冲，收集到滤板上并计数。 图4显示两组实验的结果，称为“dnr1”和“dnr2”。利用抗OX40L单克隆 抗体8E12(空心正方形)和单克隆抗体13G5(空心圆)的处理均显著抑制 T细胞的增殖，表明这两种抗体抑制OX40L信号转导。相反，对照小鼠IgG1 (X′s)不抑制T细胞增殖。空心菱形显示T细胞增殖的对照水平，实心正方 形显示与活化pDC共培养的T细胞的水平。不同供体间抗OX40L单克隆抗体 抑制T细胞增殖的IC50不同，范围从0.5到10nM。 实施例7：抗OX40L抗体处理抑制T记忆细胞的IL-2产生 测定T记忆细胞的IL-2产生以确定抗OX40L单克隆抗体对OX40L-OX40 相互作用的阻断是否抑制IL-2产生。该实验检测抗OX40L抗体抑制OX40L信 号转导的能力。简单来说，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotec)利用MACS 珠子从人血液分离CD45RO+记忆T细胞。细胞以1×106个细胞/ml浓度在包含 RPMI/10％胎牛血清/2mM L-谷氨酰胺的培养基中培养，用1μg/ml抗-CD3抗 体(BD Pharmingen)和10nM可溶性人OX40L蛋白(R & D Systems)刺激16小 时。添加指定浓度的抗OX40L抗体或者对照mIgG1抗体。按照制造商的说明 书(R & D Systems)利用ELISA试剂盒测量上清中IL-2的水平。 图5显示两组实验的结果，称为“dnr5”和“dnr6”。利用单克隆抗体8E12(空 心正方形)和单克隆抗体13G5(空心圆)的处理均显著抑制T记忆细胞的IL-2 产生。相反，对照小鼠IgG1(X′s)的添加不抑制IL-2产生。带阴影的正方形 显示用抗CD3抗体单独处理时记忆T细胞产生IL-2的水平，实心正方形显示用 抗CD3抗体和人OX40L单独处理时产生的IL-2的水平，或者空心菱形显示单 独的T记忆细胞。 实施例8：抗OX40L抗体处理抑制活化T细胞的存活 测定活化T细胞的存活以确定抗OX40L单克隆抗体对OX40L-OX40相互 作用的阻断是否抑制存活。这种基于细胞的实验检测抗OX40L抗体抑制 OX40L信号转导的能力。简单来说，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotec) 利用BDCA-4MACS珠子从人血液中分离浆细胞样树突状细胞(pDC)。细胞 以1×106个细胞/ml浓度在包含RPMI/10％胎牛血清/2mM L-谷氨酰胺的培养 基中培养，用2.5μg/ml可溶性人CD40L蛋白(R & D Systems)和10ng/ml人IL-3 蛋白(R & D Systems)刺激3天。然后对CD123+BDCA2活化的pDC进行FACS 分类，并与活化的T细胞共培养。根据制造商的说明书(Miltenyi Biotec)利用 MACS珠子通过阴性选择从人血液分离T细胞，用0.1μg/ml抗-CD3/1μg/ml 抗-CD28(BD Pharmingen)活化3天。在指定试剂(1nM或者10nM浓度)存 在条件下，以1:50的pDC:T细胞比例，在6孔板中以每ml 1×106个T细胞的浓 度进行共培养。通过台盼蓝拒染法按时间测定细胞数目。 图6显示实验的结果。利用抗O X 40L mab 8E12(空心正方形)和mab 13G5 (空心圆)的处理均显著抑制活化T细胞的存活。相反，对照小鼠IgG1 (“mIgG1”；X′s)的添加不抑制活化T细胞的存活。空心菱形显示单独T细胞 的对照(“未刺激(unstim)”)，实心正方形显示与活化的pDC(“ac.pDC”)共培养 的T细胞的对照。 尽管为了便于理解对上述发明利用具体的说明和实施例已经进行了详 细描述，但说明书和实施例不应被理解为限制本发明的范围。 相关申请的交叉引用 本申请要求在35 USC§119下享有2005年12月16日提交的US临时申请 60/751,377的优先权，其完整内容在此引入作为参考。