技术领域 本发明属于生物医学技术领域，涉及噬菌体芯片的制备及其应用，特别 涉及展示外源抗原肽的噬菌体生物芯片的制备及其应用。本发明将展示外源 肽的不同噬菌体按照设计的阵列方式固定于芯片片基上，获得噬菌体芯片， 该芯片既可作为展示外源肽的蛋白类芯片，用于人体或实验动物各种样本中 抗体、配体和天然或人工合成物中特异性结合物的检测、鉴定和筛选，也可 作为基因芯片，用于特异性基因的检测、鉴定和筛选。 背景技术 生物芯片主要是指通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型 生物化学分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类 以及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。常见的生物芯片分为 三类：第一类为微阵列芯片，包括基因芯片(Gene chip，DNA chip，DNA microarray)、蛋白芯片(Protein chip)、细胞芯片和组织芯片(cell chip and tissue chip，cell microarray and tissue microarray)；第二类为微流控芯片 (microfluid)(属于主动式芯片)，包括各类样品制备芯片、聚合酶链反应 (PCR)芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等；第三类为以生物芯片为基础 的集成化分析系统或称芯片实验室(Lab-on-a-chip)。它是集分子生物学、 免疫学、半导体、微电子、激光、化学染料等领域的最新科学研究成果于一 体的前沿高新技术，其应用几乎涵盖了生物、医学、药学、农学、环保、法 医、卫生学等所有生物技术的领域。生物芯片技术的突然崛起及其将带来的 巨大商业价值和应用前景引起了世界各国的广泛关注和重视，正在成为21 世纪最具发展潜力的生物产业之一。目前最为成熟，并广泛使用的是基因芯 片，但是，由于蛋白质是各种生命现象的真正功能实现这和执行者，因此， 蛋白芯片将具有更为广阔的应用前景。但是，如何高通量获得、纯化各种不 同的蛋白质分子用于蛋白芯片的制备，仍旧存在诸多的技术瓶颈和难以克服 的技术障碍。此外，由于蛋白质有着较为复杂的空间结构特征，将蛋白质偶 联到芯片上有可能破坏蛋白质的空间结构，使蛋白质丧失活性。 特别对于 分子量＞105道尔顿且结构较复杂的蛋白质，而言难度更大；再者，将大量 物理和化学性质不同的蛋白质分子偶联道同一芯片片基上时，芯片片基的处 理技术也是必需考虑的问题和技术难点。正因为如此，将物理化学性质基本 相同而生物活性不同的抗体偶联于同一张芯片片基制备蛋白质抗体芯片的 技术难度较低，而发展迅速外，蛋白质芯片的发展仍面临诸多技术问题。因 此，研发新型的生物芯片具有极其重要的意义。 1985年，Smith在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出 了噬菌体展示(phage display)技术。其基本原理是通过利用化学合成、随机 突变、酶切和PCR等方法建立编码多肽、蛋白或抗体文库的DNA片段，将 外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因PIII或PVIII中，使外源DNA片段对应 的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面， 然后收集这种重组噬菌体在宿主菌中的扩增上清而构建。该技术将蛋白质分 子的表型和基因型巧妙地结合于丝状噬菌体这样一个便于对其进行一系列 生化和遗传操作的载体上，从而使融合蛋白展示在噬菌体颗粒的外部，而编 码融合残基的DNA则位于噬菌体颗粒内部。展示蛋白与其编码DNA之间的这 种物理联系使得我们可以通过一种简单的“生物淘选”来对大量的蛋白变 异株进行筛选，通过进一步的功能鉴定得到能与靶分子特异结合的噬菌体克 隆。根据噬菌体克隆所展示多肽或蛋白与相应编码基因一一对应的关系就可 明确与靶分子对应的配体的基因型和表型特点。且每个蛋白都能与其相应的 DNA序列联系起来。 近年来，朱圣庚领导的研究组通过对噬菌体抗体库的筛选，将展示不同 单链抗体的噬菌体偶联于硅片上，制备噬菌体抗体芯片(phage antibody chip)用于特异性抗原的识别和蛋白质组学研究(洪龙，廖玮，魏芳，赵新 生，朱圣庚.用于识别不同细胞蛋白质组的噬菌体抗体芯片.物理化学学 报.2004；20(10)：1182-1185；廖玮，洪龙，魏芳，朱圣庚，赵新生.利用的 展示系统改进噬菌体抗体芯片.物理化学学报.2005，21(5)：508-511；岑晓 东，王文娟，赵新生，汪玄，沈悌，谭涛超，毕群，朱圣庚.高密度噬菌体 抗体芯片对细胞表面蛋白的识别.物理化学学报.2006，22(7)：777～779)。 尽管，噬菌体抗体芯片，不同于传统蛋白质抗体芯片，利用展示抗体片段的 噬菌体替代传统单抗制备噬菌体抗体芯片具有很多优势：①通过亲和淘选噬 菌体抗体库，获得针对各种抗原的噬菌体抗体，无需免疫动物；②通过单克 隆扩增获得噬菌体抗体， 避免了步骤繁琐的单抗制备和纯化过程；③避免 了芯片表面对抗体决定区的直接干扰(Arnaud，M.C.；Gazarian，T.； Rodriguez，Y.P.；Gazarian，K.；Sakanyan，V.Proteomics，2004， 4：1959.Cekaite，L.；Haug，O.；Myklebost，O.；Aldrin，M.；Ostenstad， B.；Holden，M.；Frigessi，A.；Hovig，E.；Sioud，M.Proteomics， 2004，4：2572.)。但是，噬菌体抗体芯片与蛋白质抗体芯片一样，也只能用 于检测和筛选特异性抗原，并不能用于人体或实验动物各种样本中抗体、配 体和天然或人工合成物中特异性结合物的检测、鉴定和筛选，也不能作为基 因芯片，用于特异性基因的检测、鉴定和筛选。因此，研制可用于特异性抗 体、配体的检测和筛选噬菌体芯片，仍具有重大意义和现实必要性。 噬菌体肽库是噬菌体展示技术的一个非常重要的分支。1990年Scatt (Scott JK，Smith GP.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science，1990；249(1)：386-390.)设计并建立了噬菌体随机肽 库(phage random peptide library)。该噬菌体肽库通过将不同短肽的基 因序列插入噬菌体单链DNA中，使表达的外源随机序列多肽与丝状噬菌体的 表面外壳蛋白的N端融合形成具有一定的空间构象的融合蛋白，呈现于噬菌 体表面，并可作为任何靶抗原表位的模拟肽(minotope)。尽管噬菌体随机肽 库展示的随机肽段序列与天然分子并无相似之处，但却仍旧具有与天然分子 相类似的功能或抗原性。如从噬菌体表面随机短肽库中筛选出模拟环状小肽 (U.S.Patent No.5,835,382)，虽然其序列与天然EPO的序列亦无相似 之处，但是它的确能够与EPO受体高亲合力结合，并且模拟促红细胞生成素 (EPO)的功能。长期以来，噬菌体肽库技术因其在抗原表位的分析中的特 殊优势，在基因疫苗、多肽疫苗和重组疫苗的研究中发挥着巨大的作用 (Matthew A.S，Deborah S，Kenichi M，et al.HSV-1 amplicon peptide display vector.J Vir Meth.2002；107：71-79)。目前，噬菌体随机肽 库的随机多样性可达107～109，短肽长度已由最初的6肽、7肽发展到9肽、 15肽，直到38肽、40肽，噬菌体随机肽库是目前噬菌体展示肽库中应用最 广的肽库之一(Ming-juan Zhang，Jun Yang，Zhuo-ren Lu.A New Ouabain Conjugated Peptide Was Found From Phage Displayed Peptide Library. Am J Hypert.2004，17：619-623；张明娟，杨军，吕卓人.噬菌体肽文库的 筛选.临床检验杂志，2002；20(4)：247-248)。 发明内容 本发明的目的在于提供一种噬菌体芯片的新用途，特别是将展示不同外 源肽的噬菌体直接通过人或非人工的方法，按照预先设计的阵列模式偶联于 同一芯片片基上制备噬菌体芯片，该噬菌体芯片既可作为蛋白类芯片，用于 人体或实验动物各种样本中抗体、配体和天然或人工合成物中特异性结合物 的检测、鉴定和筛选，也可作为基因芯片，用于基因的检测、鉴定和筛选。 为实现上述任务，本发明采用噬菌体展示技术，筛选噬菌体肽库或构建 噬菌体展示库，获得展示特异性外源肽(或抗原表位)的噬菌体克隆，利用 自动或非自动方式，按照设计的阵列模式将展示不同外源肽的噬菌体直接偶 联于同一芯片片基上，获得噬菌体芯片。该芯片既可作为展示外源肽的蛋白 类芯片，用于人体和实验动物各种样本中抗体、配体及天然或人工合成物中 特异性结合物的检测、筛选和鉴定，也可作为克隆相关基因的基因芯片，用 于基因的检测、鉴定和筛选。 本发明的创新性之处在于：①筛选噬菌体肽库的抗体可直接来自患者， 勿需表达、纯化相应抗原，也勿需免疫动物制备抗体，在预先不知道诊断用 靶抗原的情况下，使用患者血清从抗原决定簇库中筛选出展示特异性抗原决 定簇的噬菌体，这种噬菌体只能与病人血清抗体反应，而不能与正常人的血 清反应，从而建立起疾病的特异性诊断方法；②利用噬菌体展示技术，通过 对噬菌体随机肽库或抗原库的亲和淘选，即可获得展示相关特异性外源肽 (抗原表位)的噬菌体，通过简单的单克隆扩增，即可高通量获得大量重组 噬菌体，同时，噬菌体颗粒稳定，易于长期保存，避免了步骤繁琐而复杂的 蛋白表达和纯化过程以及蛋白质的降解；③由于所有展示不同外源肽的噬 菌体均具有完全相同的遗传背景，因而通过相同的偶联方式固定于芯片片基 上，最大程度降低了芯片片基的处理难度，利于噬菌体芯片制备条件的优化 和规范化操作及芯片质量的控制；④采用展示不同外源肽的噬菌体替代传统 蛋白分子制备生物芯片，避免了芯片表面的对抗蛋白分子的直接干扰，最大 程度上保持了展示蛋白分子的结构特征和生物活性，降低抗原-抗体(受体- 配体)之间结合的空间位阻效应，大幅度提高了噬菌体芯片的灵敏度和信噪 比；⑤噬菌体展示技术将蛋白质分子的表型和基因型结合于丝状噬菌体这 一微生物载体，将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体 表面，同时将其遗传密码整合于噬菌体基因组，因而既可作为展示外源肽的 蛋白类芯片，用于人体和实验动物各种样本中抗体、配体及天然或人工合成 物中特异性结合物的检测、筛选和鉴定，也可作为克隆相关基因的基因芯片， 用于基因检测。 因此，本发明具有广阔的应用前景和市场。 附图说明 图1展示抗HPVl6 L1抗原模拟肽的噬菌体芯片检测小鼠抗HPVl6L1 VLP抗血清。 以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。 具体实施方式 本发明利用噬菌体展示技术，通过筛选噬菌体肽库或噬菌体抗原库，获 得展示特异性外源肽(或抗原表位)的噬菌体克隆，将展示不同外源肽的噬 菌体直接通过人工或非人工的方法，按照预先设计的阵列模式偶联于同一芯 片片基上制备生物芯片，有可能成为一类与传统意义上的基因芯片和蛋白芯 片完全不同的新型生物芯片——噬菌体芯片(phage chip or phage microarray)，该芯片既可作为展示外源肽的蛋白类芯片，用于人体或实验 动物各种样本中抗体、配体和天然或人工合成物中特异性结合物的检测、鉴 定和筛选，也可作为基因芯片，用于基因的检测、鉴定和筛选。 1.展示特异性外源肽或抗原表位的噬菌体克隆的筛选和鉴定 1.1采用特异性的抗体或血清(可来自患者或实验动物)，或者各种天然 或人工合成的蛋白或非蛋白类物质。通过简单的“吸咐—洗脱—扩增”的方 法，筛选噬菌体随机肽库(phage random peptide library)，挑取单克隆 噬菌体，经扩增、DNA的提取、测序和同源性分析，确定展示特异性外源肽 或抗原表位的噬菌体克隆保存备用(方法详见Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit说明书)。 1.2通过PCR等分子克隆技术获得靶蛋白基因序列，将其插入噬菌体展 示系统(如单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示 系统等)，构建噬菌体展示库(具体方法参见《分子克隆》)。常规方法制备 该蛋白的抗血清或抗体，通过“吸咐—洗脱—扩增”的方法，筛选上述构建 的噬菌体展示库(phage display library)，挑取单克隆噬菌体，或者直接 随机挑取单克隆噬菌体，并经扩增、DNA的提取、测序和同源性分析，确定 展示特异性抗原表位的噬菌体克隆保存备用(方法同前)。 2.噬菌体芯片的制备： 采用人工或非人工的方法和相应设备将上述获得的展示特异性外源肽 或抗原表位的噬菌体按照设计好的阵列模式偶联至不同芯片片基上，如载玻 片、硅片、瓷片、尼龙膜、PVDF膜、NC膜、聚丙烯酰胺凝胶或者磁珠、 琼脂糖等不同的微珠，即可获得噬菌体芯片。同时，上述芯片片基可经过或 不经过醛基化、巯基化、氨基化或环氧基等不同活化处理，以利于噬菌体以 各种可能的方式展现在芯片片基上载玻片的表面。 3.噬菌体芯片的应用： 3.1本发明所提供的噬菌体芯片可作为展示外源肽或抗原表位的蛋白 芯片，用于人体或实验动物各种样本中抗体、配体和天然或人工合成物中特 异性配体或结合物的检测、筛选和鉴定，具体方法如下： 3.1.1噬菌体芯片在抗体检测中的应用： (1)常规方法封闭制备好的噬菌体芯片，加入稀释好的人体或实验动 物抗血清、抗体、体液或组织提取液，4℃过夜或室温孵育，采用PBS缓冲 液冲洗，加入荧光或者非荧光标记的第二抗体，37℃孵育，PBS缓冲液冲洗 后放入芯片阅读仪中进行结果分析。 (2)按照常规方法对含有被检测抗体进行荧光或者非荧光标记。封闭 制备好的噬菌体芯片，加入按照一定比例稀释的含有被标记抗体，4℃过夜 或室温孵育，采用PBS缓冲液冲洗，37℃孵育，PBS缓冲液冲洗后放入芯片 阅读仪中进行结果分析。 3.1.2噬菌体芯片在配体检测中的应用： 按照常规方法对含有被检测配体的人体或实验动物体血清、体液、组织 提取液及天然或人工合成物中特异性配体或结合物，进行荧光或者非荧光标 记。常规方法封闭制备好的噬菌体芯片，加入按照一定比例稀释的含有被标 记配体的提取液，4℃过夜或37℃孵育，PBS缓冲液冲洗后放入芯片阅读仪 中进行结果分析。 3.1.3噬菌体芯片在配体筛选中的应用 (1)常规方法封闭制备好的噬菌体芯片，加入按照一定比例稀释的含 有被检测配体的人体或实验动物体血清、体液、组织提取液及天然或人工合 成物中特异性配体或结合物，4℃过夜或室温孵育或37℃孵育，PBS缓冲液 冲洗，采用表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术， 进行配体筛选。 (2)常规方法封闭制备好的噬菌体微珠芯片(phage Bead Array)，加入 按照一定比例稀释的含有被检测配体的人体或实验动物体血清、体液、组织 提取液及天然或人工合成物中特异性配体或结合物，4℃过夜或室温孵育或 37℃孵育，PBS缓冲液冲洗，常规方法分离微珠，进行配体筛选。 3.2本发明所提供的噬菌体芯片可作为整合靶基因的基因芯片，用于人 体或实验动物血液、体液、分泌物、组织提取液或人工合成基因(如DNA 或者RNA)的检测、鉴定和筛选。 3.2.1用于人体或实验动物血液、体液、分泌物、组织提取液或人工合 成基因(如DNA或者RNA)的检测、鉴定。 常规方法提取人体或实验动物血液、体液、分泌物、组织提取液或人工 合成基因(如DNA或者RNA。如果是mRNA后，反转录为cDNA，然后将 cDNA剪切为200～600bp长的片段，筛选cDNA3’端，用PCR扩增的方法获 得足够量的cDNA)。在采用放射标记技术或者荧光标记技术进行基因的标 记，质谱分析或化学发光等进行基因芯片的检测。 以下是发明人给出的实施例，需要说明的是以下的实施例仅用于理解、 描述本发明，本发明并不限于这些实施例。 实施例中采用的质粒、噬菌体随机肽库及主要试剂如下： 噬菌体随机十二肽库(Ph.D.12TM Phage Display Peptide Library)和 E.coli ER2738(Cat.8110S)购自New England Biolabs公司；Protein G Magnetic Beads购自New England BioLabs公司；HPV-16 L1单克隆抗体购自 Neomarker公司；HRP-IgG购自DAKO公司；Cy3 dUTP/Cy5 dUTP购自 美国Amersham Pharmacia公司。 总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司.Gen III Microarray Spotter芯 片点样仪购自Amersham Pharmacia公司；恒温杂交箱购自Shellab公司；芯 片扫描仪购自Amersham Pharmacia公司；聚合酶链反应(PCR)仪购自MJ Research公司；ScanArray 3000激光共聚焦扫描仪，General Scanning Inc； PTC-100 PCR扩增仪，MJ Research Inc；UV-2000紫外透射分析仪，上海天 能科技有限公司。 本实施例中涉及到的各种试剂的配置和方法参见《分子克隆》、 《ProBondTM纯化系统说明书》、《New England BioLabs公司Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit说明书》等。 实施例1：噬菌体芯片的制备 1.展示外源肽或抗原表位的噬菌体的筛选和鉴定 方法1：噬菌体随机肽库的筛选和鉴定 (1)常规方法采集并分离人体或实验动物的血清、抗体、体液或组织 提取液。 (2)“生物淘选”法筛选噬菌体随机肽库：取扩增并稀释后的噬菌体 肽库(1.0×1011pfu)，和300ng正常兔IgG溶液到2ml结合液中，37℃，振 荡孵育50rpm，1h进行预吸附，加入蛋白G标记的磁珠50μl，37℃，振荡 孵育50rpm 20min后，磁力吸附2min，取上清，用1/6体积2.5M PEG/NaCl 沉淀，200μlTBS溶解，加入到2ml含300ng抗体的人体或实验动物的血清、 抗体、体液或组织提取的结合液中，37℃，孵育1h，加入蛋白G标记的磁 珠50μl，37℃，振荡孵育50rpm，20min，磁力吸附2min，TBST (TBS+0.1％Tween-20)冲洗，5min×3次，加入100μl 0.2M glycine-HCl(pH2.2)，1mg/mlBSA，轻轻摇晃10min，磁力吸附5min，收集 洗脱液，加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和，检测噬菌体滴度，留取20μl用于 保存，对其余洗脱液加入到20ml ER2738培养液(已达对数生长期)中，在 37℃，230rpm，孵育4.5h。1/6体积2.5M PEG/NaCl沉淀，200μl TBS溶 解即为已扩增的噬菌体，检测噬菌体滴度，4℃保存。取等量噬菌体 (1.0×1011pfu)重复上述筛选过程3次，检测第3次洗脱液的噬菌体滴度 (方法详见Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit说明书)。 (3)快速纯化噬菌体测序模板及测序：用无菌的木签，随机蘸取测定 第3次洗脱液噬菌体滴度的双层琼脂培养皿中的蓝色噬菌体菌斑，投入含 5ml已达指数生长期的ER2738培养液中，在37℃，剧烈震荡孵育230rpm， 4.5h。离心后取上清液并再次离心，取80％上清，NaI法快速纯化噬菌体测 序模板(方法详见Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit说明书)， 琼脂糖凝胶电泳检测，上海华诺生物科技有限公司测序。 (40)序列分析：采用NCBI的Blastn和Blastp分析，并经同源性分析 确定展示特异性外源肽或抗原表位的噬菌体克隆。 方法2：噬菌体展示库的构建和筛选 (1)特异性蛋白噬菌体展示库的构建：通过PCR等分子克隆技术获得 靶蛋白基因序列，将其插入单链丝状噬菌体展示系统，构建噬菌体展示库(具 体方法参见《分子克隆》)。 (2)噬菌体克隆的筛选：常规方法制备该蛋白的抗血清或抗体，通过 “吸咐—洗脱—扩增”的方法，筛选上述构建的噬菌体展示库(phage display library)，挑取单克隆噬菌体，或者直接随机挑取单克隆噬菌体， 经扩增、DNA的提取、测序和同源性分析，确定展示特异性抗原表位的噬菌 体克隆保存备用(方法同前)。 2.噬菌体芯片的制备 采用人工或非人工的方法和相应设备将上述获得的展示特异性外源肽 或抗原表位的噬菌体按照设计好的阵列模式偶联至不同芯片片基上，如载玻 片、硅片、瓷片、尼龙膜、PVDF膜、NC膜、聚丙烯酰胺凝胶或者磁珠、 琼脂糖等不同的微珠，即可获得噬菌体芯片。同时，上述芯片片基可经过或 不经过醛基化、巯基化、氨基化或环氧基等不同活化处理，以利于噬菌体以 各种可能的方式展现在芯片片基上载玻片的表面。方法如下：采用芯片点样 仪将上述经过鉴定的展示特异性外源肽的噬菌体的溶液1μl按照预先设计 的阵列模式偶联至NC膜上，并设阴性对照。 实施例2：噬菌体芯片在抗体检测中的应用 方法1：5％脱脂奶室温封闭2h制备好的噬菌体芯片，加入1∶500稀释 的待检测样，本室温孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20的TBS)洗，10min×3， 1∶1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG室温孵育20min，TBST洗10min×3， DAB显色。即可检测出样本中的特异性抗体(图1)。 方法2：常规法分离样本中的抗体，采用Cy3荧光标记法进行抗体的标 记(Cy3荧光标记试剂盒购自Pharmacia公司)。5％脱脂奶室温封闭噬菌体 芯片，加入Cy3标记的待检测样，本室温孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20 的TBS)洗，10min×3，荧光扫描仪判读结果。 实施例3：噬菌体芯片在配体检测中的应用 采用常规法制备、分离样本中配体，采用Cy3荧光标记法进行全蛋白 标记(Cy3荧光标记试剂盒购自Pharmacia公司)。5％脱脂奶室温封闭噬菌 体芯片，加入Cy3标记的待检测样，本室温孵育2h，TBST(含0.5％Tween-20 的TBS)洗，10min×3，荧光扫描仪判读结果。 实施例4：噬菌体芯片在配体筛选中的应用 方法1：常规方法封闭制备好的噬菌体芯片，加入按照一定比例稀释的 含有被检测配体的人体或实验动物体血清、体液、组织提取液及天然或人工 合成物中特异性配体或结合物，4℃过夜或室温孵育或37℃孵育，PBS缓冲 液冲洗，采用表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技 术，进行配体筛选。 方法2：常规方法封闭制备好的噬菌体微珠芯片(phage Bead Array)， 加入按照一定比例稀释的含有被检测配体的人体或实验动物体血清、体液、 组织提取液及天然或人工合成物中特异性配体或结合物，4℃过夜或室温孵 育或37℃孵育，PBS缓冲液冲洗，常规方法分离微珠，进行配体筛选。 实施例5：噬菌体芯片在基因检测中的应用 常规方法分离人体或实验动物离体新鲜组织样本，切成多个1cm3小块， 在RNase-Free 0.9％生理盐水中漂洗样品，提取样本中mRNA后，反转录为 cDNA，然后将cDNA剪切为50～600bp长的片段，筛选cDNA3’端，用PCR扩 增的方法获得足够量的cDNA。 参照Draghici方法(Draghici S，Kulaeva O，HoffB，Petrov A，Shams S， Tainsky MA.Noise sampling method：an ANOVA approach allowing robust selection of differentially regulated genes measured by DNA microarrays. Bioinformatics.2003；19：1348-1359.)行cDNA单链探针并纯化(Cy3荧光标 记试剂盒购自Pharmacia公司)。用Cy3 dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5 dUTP标记样本组织mRNA.具体方法是：取稀释60倍的cDNA克隆溶液作 为模板，加入引物和10×反应缓冲液5μl，10nmol的dATP，dCTP，dGTP 和5nmol的dTTP，1mmol/L的Cy3-dUTP 1μl和3U Tag酶，加水调终体积 为50μl。采用0.2ml的薄壁管，按94℃，5min，(94℃，40s；55℃，40s； 72℃，90s)×30，72℃，5min的扩增程序扩增得到目的条带，然后用PCR 纯化试剂盒纯化扩增产物，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2％SDS缓冲 液中，终浓度约为50ng/μl。 检测标记的荧光含量。用分光光度计检测260nm，550nm，650nm时 的A值，然后计算出荧光含量。将标记好的探针(Cy3/Cy5)按等量混匀，溶 解在30μL的杂交缓冲液中。将芯片和杂交混合探针分别置于95℃双蒸水 浴中变性5min，立即将混合探针加在噬菌体芯片上，置于湿盒中65℃杂交 4h，然后置2×SSC，0.1％SDS溶液中洗5min，0.1×SSC，0.1％SDS溶液中 洗5min，0.1×SSC溶液中荡洗数遍，晾干。ScanArray3000激光共聚焦扫 描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号后进行数据分析和处理。